流式细胞术dun0.pptx

第六章流式细胞术第六章流式细胞术第一节流式细胞术概述FCM特点①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。FCM发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果，在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等基础学科和医学、检验学等应用学科得到广泛应用。目前使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产：BECKMAN-COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型：临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。综合型除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。第二节流式细胞术发展简史1953年Crosland-Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：(1)细胞的组分是可以用光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。(2)细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是VanDilla和美国的LosAlamos小组。1967年该研究组研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。第三节流式细胞仪主要技术指标3.1流式细胞仪的分析速度一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。3.2流式细胞仪的荧光检测灵敏度最多能测出单个细胞上达600个的荧光分子，两个细胞间的荧光差大于5%即可区分。3.3前向角散射（FSC）光检测灵敏度前向角散射反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm。3.4流式细胞仪的分辨率用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到低于2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。3.5流式细胞仪的分选速度一般流式细胞仪分选速度大于1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。第四节流式细胞仪主要构造和工作原理流式细胞仪结构示意图4.1流动室及液流驱动系统流动室(FlowCell或FlowChamber)是流式细胞仪的核心部件流动室由石英玻璃制成单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室孔径有60μm、100μm、150μm、250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成。调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。4.2激光光源及光束形成系统流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度