流式细胞术.doc

流式细胞术在生物医学中的应用（FlowcytometerFCM）
一、FCM：
对单细胞定量分析，分选的新技术。它可研究一个细胞从新生到死亡，从细胞膜，细胞浆到核内物质（染色体），探讨细胞内不同物质间的关系。它可得到多种参数（DNA、RNA、Pr等），进行高信息分析，为生物医学研究提供强有力的手段。
二．特点
1．高速度16,000/s
2．高灵敏度
每个细胞只要有100个荧光分子（异硫氰酸荧光等）就可以检测出来；两个细胞间2%的差别；光散射灵敏度0.3m。
3．高精度及高分辨率
CV<1%，每个参数可达到256～4096通道分辨力。
4．分选区纯度高（99%），分选收获率高（90%），并可对活细胞进行分选。
5．多参数同时分析
一个细胞中可同时测定DNA、RNA等多个参量。
四、染料：
1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）
是检测细胞总蛋白最常用的荧光染料，它是酸性染料，易溶于水，以其异硫氰基共价键方式结合到蛋白的带正电荷的基因上，以蓝光激发后发出明亮的黄绿色荧光，FITC既能标高细胞内总和，又能更广泛地标高各种特异配体（外源凝集素、亲和素、激素、脂类、蛋白类似物及Ab等）。每个被标高分子上可标记2～8个FITC分子。FITC有较高的消光系数和量子产额，适用于氩离子激光器的488nm谱线激发。
2．碘化丙啶（Propidinmiodide,PI）和溴化乙锭（ethidinmbromide,EB）DNA检测常用的荧光染料它们嵌入双链DNA碱基对中与之结合，无碱基特异性。为获得DNA分布参数，染色前用RNA处理细胞，排除双链RNA的干扰。PI和EB都不能进入细胞膜完整的细胞中，只有死亡的细胞才能使染料进入。PI（630nM）比EB（615nM）的发射光谱峰向长波方向移动，因而做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易区分和测量。PI比EB测得的DNA分布的CV值低，所以PI应用更广泛些。
3．吖啶橙（wcridineorange,AO）和派若宁（PY）是三环尖芳香染料，可标记DNA、RNA为异染性荧光染料对细胞内DNA和RNA进行定量测量。AO和核酸结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸根发生静电间相互作用，如果用荧光激发，前者发射峰值530nm的绿色荧光后者为发射峰值为640nm的红色荧光。
五、应用
（1）流式免疫荧光技术
细胞表面标记及抗原决定簇性质的研究，特别是肿瘤细胞表面标志的研究及细胞分类和亚群的分析上占有重要地位。
（2）细胞DNA检测
经DNA特异性染料染色的细胞群体，通过测量已受激光照射后发生特异性荧光，在一定条件下，荧光强度与细胞内DNA含量成正比。