流式细胞术步骤.doc

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞按每孔4×105个的密度接种于60mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。(设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L辛伐他汀组正常对照组(NC组)：胰岛素终浓度0.058mg/LA组：辛伐他汀终浓度2μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；B组：辛伐他汀终浓度5μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；C组：辛伐他汀终浓度10μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；于37℃，5%CO2培养箱中孵育48h）胰酶消化收集细胞，并用1mLPBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。800rpm离心5分钟，去除上清，加5mLPBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.5mLPBS中。用低速振荡器边震动边加入5mL预冷的70%乙醇，固定，4℃过夜。次日将固定好的细胞以1000rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4mLPBS清洗一次，用0.4mLPBS重悬细胞。加入5μLRNaseA（10mg/ml）37℃消化1小时，加入终浓度50mg/mL碘化丙啶（propidiumiodidePI）4℃避光染色过夜（或者37℃避光染色1小时），在EPICSXL流式细胞仪上分析。利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化细胞按每孔4×105个的密度接种于60mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。2．胰酶消化收集细胞，并用1mLPBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。3.800rpm离心5分钟，去除上清，加5mLPBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.1mLPBS中，并转移到1.5mL离心管中。4.按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。5.1500rpm，小型离心机离心5分钟，去除上清，加1mLPBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mLPBS中。6.分别将荧光二抗DyLight488、DyLight567按照1:100比例加入细胞悬液中，室温孵育1小时。7.1500rpm离心5分钟，去除上清，加1mLPBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬细胞于0.2mLPBS中。用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在EPICSXL流式细胞仪上分析。IR检测类型细胞NC组NC组NC组A组B组C组一抗无IgG1IRIRIRIR二抗无DyLight488DyLight488DyLight488DyLight488DyLight488目的空白对照同型对照实验组对照实验组1实验组2实验组3GLUT4检测类型细胞NC组NC组NC组A组B组C组一抗无IgG2aGLUT4GLUT4GLUT4GLUT4二抗无DyLight567DyLight567DyLight567DyLight567DyLight567目的空白对照同型对照实验组对照实验组1实验组2实验组3（因为IR和GLUT4同样为鼠源抗体，并且分开进行检测，二抗颜色可进行调试。尽可能选择效果好的同一种二抗。可能使用一绿一红，也可能使用两个同样颜色的二抗）