单克隆抗体与基因工程抗体的制备优秀课件优品文档.ppt

单克隆抗体与基因工程抗体的制备抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)杂交瘤技术的基本原理基本概念⑴连接反应一般在灭菌的0.⑶轻轻混匀，16℃30min。5、用凝胶成像系统进行分析。许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。工作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统CATATG高度的均一性和可重复性单克隆抗体与基因工程抗体的制备T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；12345融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。Hydrophobicinteractionchromatography(HIC)⑴连接反应一般在灭菌的表达载体2μL低温高速离心机、超声波粉碎仪、光学显微镜三、单克隆抗体的性质鉴定目的片段3μL杂交瘤技术的基本原理流程不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10)50%PEG1min内加完;10ml培养液终止反应SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置45秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7-14天，换用HT培养液7～20天出现克隆HAT筛选挑克隆HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生Hydrophobicinteractionchromatography(HIC)TemplatecDNA5.4、染色与脱色电泳结束后，分离玻璃板，取出凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考马氏亮蓝中振荡染色约1h，再转入脱色液中脱色。分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。沉淀反应无有特异性高低以每克包含体与50ml包含体溶解液的比例配成混悬液，室温搅拌15小时，然后15℃、15000g离心20分钟留取上清，即得血管抑素抽提液。CTAGA细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性CATATG纯化的片段及载体TCTAGA盐析沉淀亲和层析离子交换层析Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot四、单克隆抗体的特性优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低McAbandPcAb基因工程抗体制备将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体其它生物活性蛋白融合许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交