单克隆抗体与基因工程抗体的制备.ppt

第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存第三节基因工程抗体制备一、人源化抗体二、小分子抗体三、抗体融合蛋白四、双特异性抗体五、噬菌体抗体库技术第一节杂交瘤技术的基本原理抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体流程不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。。。。培养液：RPM1640培养液DMEM培养液细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化。骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培养液10～20天出现克隆HAT筛选挑克隆HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法(limitingdilution)显微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod)特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞效率最高价格昂贵配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生腹腔注射法前5天进行,预先腹腔注射pristane（1～5）×106细胞1～3w形成腹水可溶性抗原：ELISA抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）ELISAELISA多头加样枪。盐析沉淀亲和层析离子交换层析Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot四、单克隆抗体的特性优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗McA