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单克隆抗体与基因工程抗体的制备抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)杂交瘤技术的基本原理基本概念杂交瘤技术的理论基础杂交瘤技术的基本原理流程不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10)50%PEG1min内加完;10ml培养液终止反应表达载体2μL作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同AGATCTT载体的特点是将普通的克隆载体切成线状，并使之在3'末端含有一个凸出碱基T；5、用凝胶成像系统进行分析。HostchromatemeMcAb与PcAb的比较ForeignDNAtobeinserted由一个B淋巴细胞增殖而成的细胞集团阳性重组子的PCR鉴定全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、超净许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。7～20天出现克隆HAT筛选挑克隆HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生腹腔注射法盐析沉淀亲和层析离子交换层析Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot四、单克隆抗体的特性优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低McAbandPcAb基因工程抗体制备将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体其它生物活性蛋白融合许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性原理与操作技术基因工程的操作技术PCR(聚合酶链式反应)PCR技术原理示意图抗原的原核表达ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAAAGAATGGGGACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAGAACACAGAGATCAGCTTTAAGTTGGGGGTGGAGTTCGATGAGACAACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCC