单克隆抗体和基因工程抗体的制备优秀课件优质文档.ppt

单克隆抗体和基因工程抗体的制备第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术目的要求大多数抗原分子具有多个抗原决定簇（表位，epitope）。一个抗原决定簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）如免疫血清。由一个只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)。单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植及自身免疫病等。第一节杂交瘤技术的基本原理一、B淋巴细胞杂交瘤技术细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。B细胞能产生抗体，但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞不产生抗体但在体外能长期生长，二者融合，各保持其本性，既产生抗体又长期生长。其原理分为几个步骤目的是制备抗原特异的McAb，所以融合的细胞必须经抗原免疫的B细胞，通常取脾，另一是在体外长期生长又不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发性骨髓瘤细胞，具备以下特点：1.稳定、易培养2.自身不分泌Ig或CK3.融合率高4.是HGPRT缺陷株目前常用的BALB/c小鼠B细胞瘤株有P3-X63-Ag8.653C（P3.653）、Sp2/0等。为HAT敏感株，易培养,融合率高，最常选用聚乙二醇(PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容易融合。（二）选择培养基的应用细胞的DNA合成一般有两条途径氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)，三者取前缀缩写为HAT培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基选择出来的HGPRT阴性细胞株。所以，前面提到的2）瘤细胞与瘤细胞及5)未融合的瘤细胞不能生长，只有1）脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为HGPRT阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。（三）有限稀释与抗原特异性选择计数，每个孔只放一个细胞，实际是0至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培养或动物接种。另外还有其他杂交瘤技术，如人-人B淋巴细胞杂交瘤和鼠-人B淋巴细胞杂交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，生长不稳定，有的分泌IgE，有的分泌Ig的γ、κ链。B细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细胞。从理论上讲很好，但实际比较困难，在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获得抗原特异性B淋巴细胞；人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长。小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的染色体。二、T细胞杂交瘤T淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人，由于T细胞功能的多样化，制备出的T细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因子，自身反应性等。其基本过程是将激活的T细胞与酶缺陷型T淋巴细胞瘤细胞融合，可表达特异性TCR或其他功能的杂交瘤T细胞，与B细胞相以，但细胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳定，简介主要步骤。1.淋巴瘤细胞系的选择1）体外无限制快速生长2）融合率高3）不分泌淋巴因子和杀伤功能4）缺乏某一特异性表面抗原或受体5）HGPRT酶缺陷型2.特异性T细胞的制备与纯化主要有可溶性抗原诱导激活的T细胞、同种反应性T细胞、人的特异性T细胞。3.T细胞杂交瘤的筛选通常在含有HAT选择培养基上，用特异性抗体筛选产生淋巴因子的杂交瘤细胞，用抗CD3-TCR抗体筛选阳性细胞。三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养将阳性细胞进行单细胞培养，反复2～3次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变异或污染，冻存于液氮（-196℃）,冻存时加小牛血清至20%,加几滴10%二甲亚砜。杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种动物腹腔。第二节单克隆抗体的制备技术一、单克隆抗体的产生噬菌体显示指将蛋白分子或肽段基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，使噬菌体表面表达该异源性分子，主要特点是在同一病毒颗粒内将特定分子的基因型和表型统一，在噬菌体表面表达特定蛋白，在该噬菌体核心DNA中含有该蛋白的基因。一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成DNA，叶酸是重要辅酶。另有高密度培养，在单位体积内增加细胞的培养数量。3.一、B淋巴细胞杂交瘤技术如抗体CD3和抗IL-2R的Fab在体外直接介导T细胞对表达IL-2的细胞有杀伤作用。五、抗体库技术及其应