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基因工程的常规技术第一节凝胶电泳技术特点：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。2.电泳操作方法简便，电泳速度快3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。5琼脂糖凝胶电泳特点琼脂糖凝胶的配置琼脂糖凝胶的配置琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素琼脂糖凝胶的浓度影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素琼脂糖凝胶的浓度影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，荧光的强度与DNA含量成正比，如果用DNA片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。DNA的琼脂糖凝胶电泳检测29预染色的标本313233第二节分子杂交技术一、探针与探针标记1.切口平移标记372.随机引物标记二、Southern杂交（a）核酸杂交常用几种膜的性能比较SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EB染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。三、Northern杂交Southern杂交和Northern杂交的主要差别：1.对象不同（DNA/RNA）2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形成单链。RNA一般是进行变性电泳，在分离RNA的同时消除二级结构。RNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。四、Western杂交原理原理十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合.蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。带负电荷的蛋白质-SDS复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。实验原理各部分凝胶配制实验过程实验过程实验过程实验过程55五、菌落原位杂交检测重组体克隆的菌落杂交技术第三节、PCR技术PCR技术的创建一、PCR技术的基本成分TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)TaqDNA聚合酶PCR的引物引物的设计原则：4.PCR扩增的长度一般：<2kb。5.引物3’端碱基要求严格配对。Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的，延伸效率为T>G＝C>A。即当引物3′末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3′末端设计为A，以提高复制精确性。另一种理论是3′末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的3′末端不要考虑使用T。6.尽量减少自身配对。7.避免两条引物互补。8.引物要特异。9.可以在引物的5’端加上合适的酶切位点。引物的设计可以参照：两分钟StepByStep学会引物设计软件Primerpremier5.0/oligo软件dxy核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/PCR技术讨论版反应条件(2)dNTP：常用dNTP浓度为20μmol／L(可用范围为20～200μmol／L)。dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关，dNTP量过少时合成的产物减少。(3)K+离子浓度：PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是50mmol／L，但当K+离子浓度高于50mmol／L时会抑制Taq酶活力。2．模板PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反转录后再扩增。模板可以是基因组DNA或纯化的质粒DNA，当然两者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每个PCR反应中加入的模板数量可在102～105分子之间，必要时可低至50个分子，模板的