基因工程的常规技术(1)优品文档.ppt

基因工程的常规技术电泳（electrophoresis)一、琼脂糖凝胶电泳1、原理2、琼脂糖凝胶电泳的影响因素常用的电泳缓冲液电压：3-5V/cm时间：30-60min靶蛋白于第一抗体（一抗）反应Southern杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。分子越大，改变构象的时间就越长，重新定向的时间就越长，移动也就慢，反之越快。取决于所分离DNA片段的大小基因组DNA探针、cDNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针T4多核苷酸激酶5‘末端引入标记磷酸基团待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，其分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。最后通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。T4多核苷酸激酶5‘末端引入标记磷酸基团洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，其分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分离小片段DNA(1—1000bp)效果较好,其分辩力极高。聚丙烯酰胺由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。三、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）（Pulse-fieldgelelectrophoresis）第二节分子杂交技术一、基本原理杂交技术：是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的技术。二、探针与探针标记（一）探针的种类基因组DNA探针、cDNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针（二）标记物同位素标记：32P、35S、3H等非同位素标记：地高辛、生物素、荧光素等切口平移法随机引物法DnaseⅠ使DNA双链产生缺口DNA聚合酶将生物素标记的dNTP插入到缺口的3`端2）随机引物法（randompriming）以6~8个核苷酸长的序列随机的寡核苷酸作为引物，在Klenow片段作用下，加入带有标记的dNTP进行随机扩增，即可形成放射性同位素标记的DNA探针。优点：由于随机引物标记仅仅需要一种酶，比较简单，条件易于控制，杂交重复性好，所以应用较多。末端标记用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端三、分子杂交的基本方法（一）Southern杂交关键技术1、Southern印迹转移2、分子杂交1.待测DNA样品的制备、酶切2.待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜(印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测：放射性自显影/生化检测（a）Southernblot的结果T4多核苷酸激酶5‘末端引入标记磷酸基团SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳据此可粗略估计样品DNA浓度。三、分子杂交的基本方法洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。用琼脂糖凝胶作为支持介质的区带电泳法。杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳1975年，英国EdwenSouthern创建溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。最后通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。DNA分子的磷酸基团在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下DNA分子向正极泳动Southern转膜(印迹)：因而就可依据DNA分子的大小使其分离。可区分长度为50-100Kb以上，甚至Mb级别的大片段DNA分子。优点：由于随机引物标记仅仅需要一种酶，比较简单，条件易于控制，杂交重复性好，所以应用较多。（三）Western杂交主要步骤酶标记的第二抗体感谢观看