基因信息的传递基因重组与基因工程(1)优品文档.ppt

基因信息的传递基因重组与基因工程DNA重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。内切酶(recBCD)Holiday中间体二、细菌的基因转移与重组可接合质粒如F因子(Ffactor)（二）转化作用例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。（三）转导作用λ噬菌体的生活史例（二）细菌的特异位点重组hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。H2鞭毛素例（三）免疫球蛋白基因的重排重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。四、转座重组插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因插入序列的复制性转座转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因由转座子介导的转座第二节重组DNA技术重组DNA技术的发展史一、重组DNA技术相关概念技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等（二）工具酶重组DNA技术中常用的工具酶限制性核酸内切酶作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)BamHⅠ同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。（三）目的基因（四）基因载体克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准1.质粒(plasmid)重组DNA技术中常用的工具酶hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。原核表达体系（E.真核表达体系酵母、昆虫、乳类动物细胞1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉重组DNA技术的发展史转导作用(transduction)限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）（二）克隆载体的选择和构建一、重组DNA技术相关概念沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）3.粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）二、重组DNA技术基本原理以质粒为载体的DNA克隆过程（一）目的基因的获取*化学合成法获取目的基因组织或细胞染色体DN