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基因工程原理重组基因导入受体细胞基因工程原理DNA重组（限制性内切酶）运输工具——基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基因的表达基因工程的应用第五章重组基因导入受体细胞第一节受体细胞1.原核受体细胞较为理想的受体细胞：大部分没有细胞壁，便于外源DNA进入没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质基因组简单，不含线粒体、质体多为单细胞，容易获得一致性材料，易于扩大培养或发酵生长常用细菌：大肠杆菌。大肠杆菌。酵母菌表达系统的优势：结构最为简单的真核生物之一，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单培养简单遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长安全性高，无致病性，不会对外界环境造成污染具有较好的转译后加工机制，便于真核生物表达3.植物受体细胞优点：真核细胞、细胞的全能性。4.动物细胞受体细胞包括：小鼠BHK细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO，猴肾细胞等受体动物：鼠、牛、羊、鱼等第二节重组基因导入受体细胞转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受体菌，称转化子。（二）转导D突变（三）转染（四）电激穿孔（五）三亲本杂交（triparentalmating）二、重组基因导入植物受体细胞（Vir区）限制性酶切开（1）叶盘法转化植物细胞（2）整体植株接种转化法（3）原生质体共培养转化法（4）悬浮细胞共培养转化法（二）植物病毒介导基因转移（三）化学诱导DNA直接转化（2）脂质体介导基因转化（四）物理方法介导DNA直接转化（2）超声波介导转化（4）显微注射三、重组基因导入动物受体细胞（二）脂质体介导转化（三）动物病毒介导转导法第三节重组子筛选克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选（Screening）或选择(Selection)。一、遗传表型直接筛选一、遗传表型直接筛选2.插入失活筛选3.插入表达筛选。IPTGIPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。（二）利用报告基因筛选植物转化细胞荧光素酶（LUC）基因GFP：绿色荧光蛋白GFP标记的微管（三）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞（四）营养缺陷型检测法（五）形成噬菌斑筛选法二、依赖于重组子结构特征分析筛选三、核酸杂交分析常见的分子杂交：（一）分子探针(Molecularprobe)：是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质。2.非放射性探针（藻红素）（2）地高辛标记探针：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连（3）荧光素标记探针：用荧光素标记核酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。3.标记探针的方法（2）随机引物标记法（3）末端标记法（4）PCR标记法（5）光敏标记法：（6）化学衍生结合标记法：（7）交叉相连标记法：对重组体克隆进行筛选和鉴定的方法之一是利用核酸杂交法进行筛选，它包括Southern印记杂交法、Northern印记杂交、斑点印记杂交和（菌落原位杂交）杂交。各种杂交中需要对探针进行标记，其中对探针进行非放射性标记的常见标记物有（荧光素）、（生物素）、（地高辛）。标记探针的方法（切口平移标记法）、（随机引物标记法）、（末端标记法）、（PCR标记法）、（光敏标记法）、化学衍生结合标记法以及交叉相连标记法。在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是(a)(a)诱导宿主的α肽的合成(b)诱导宿主的ω肽的合成(c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂α-互补筛选属于下列哪种筛选方法：(B)A.抗药性标志选择B.标志补救C.原位杂交法D.酶联免疫吸附E.分子杂交应用α-互补筛选重组体时，含有外源基因的重组体菌落颜色应为：(C)A.紫色B.蓝色C.白色（阻遏蛋白不能表达）D.无色E.以上都不是水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（筛选标记）(C)A.促使目的基因导入宿主细胞中B.促使目的基因在宿主细胞中复制C.使目的基因容易被检测出来D.使目的基因容易成功表达建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?（二）核酸探针杂交分析（1）Southern印迹杂交1975年由英国人southern创建电转移方法：（2）Nouthern印迹杂交（1979年，J.C.Alwine等）（3）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（三）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞Vir区：激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。（6）组织细胞的原位杂交直接针对目的DNA进行筛选的方法是：(C)分