基因工程的载体和受体优品文档.ppt

基因工程的载体和受体一、用于基因克隆的载体5学时）3.载体应具备的条件（characteristicsofvector）质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体（一）质粒（plasmid）（1）质粒的自主复制性（2）质粒的不相容性（incompatibility）质粒不相容的分子机制（3）质粒的可转移性（4）携带特殊的遗传标记3.几种代表性质粒最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性决定R因子（r-determinant）。RTF为分子量约为11×106Dalton，控制质粒拷贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。R因子在细胞内的拷贝数：从1~2个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细胞。Col因子（colicinogenicfactor）只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可以编码一系列能降解复杂物质的酶，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。Ti质粒（tumorinducingplasmid）4.质粒的改造删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段的装载量灭活质粒上的某些编码基因加入易于识别的选择标记基因选择标记基因内引入内切酶的酶切位点序列---多克隆接头(Polylinker)加入特殊的基因表达调控元件（2）一个合格质粒的组成要素5.质粒的分类6.如何阅读质粒图谱RBS：ribosome-bindingsite原核RBS：SDsequence真核RBS：Kozaksequence7.重要的大肠杆菌质粒载体（2）pUC18/1926pUC18/19的正选择标记lacZ’的显色原理蓝白斑筛选pUC18/19质粒上的LacZ基因包括一段β-半乳糖苷酶的启动子、编码α肽链的区段、一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。当菌体中含有带lacz‘的质粒后，质粒lacz’基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用，使X-gal生成蓝色物质，这种现象即α-互补。用这种质粒进行克隆时，如果外源基因破坏了LacZ的编码序列，所产生的蛋白产物就会丧失α-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑，可用于重组子的筛选。标志补救（ß-半乳糖苷酶法）（LacZ’基因序列）抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。构建策略：将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白基因序列中的CAG密码子突变成UAG。在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体自主复制繁殖性能，使外源基因在受体细胞中高效扩增同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体具有较高的外源DNA的装载能力。通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertionvectors）。载体应具备的条件（characteristicsofvector）最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。cossite-carryingplasmid遗传背景清楚，载体、受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。8.质粒DNA的分离纯化（1）氯化铯密度梯度离心法（2）碱裂解法溶液I：调节pH，悬浮菌体，抑制DNase的活性溶液II：裂解细胞膜（主要是NaOH），临用前配制，SDS是为沉淀染色体DN