基因工程载体优品文档.ppt

基因工程载体载体类型基因工程所用的载体都经过人工重新构建克隆载体与表达载体克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并使外源DNA大量扩增。表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。第一节.质粒野生型质粒的大小一般在2-200Kb基因工程常用者在2-4Kb之间质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。质粒(plasmid)1.质粒类型:严紧型质粒(stringentplasmid)1-5个拷贝/细胞2.质粒载体必须具备的条件（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。质粒性质不相容性（不亲和性）具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。3.质粒载体的选择性标记抗菌素名称抗菌素作用方式宿主菌抗性机理复制起点常用的质粒载体4.融合表达载体如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST与目的蛋白的融合体。融合表达载体的优点例如加装一段编码Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子Ⅹa切割，从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。QIAexpress6His表达系统第二节噬菌体类噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名为Bacteriophage,简称phage。噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。噬菌体（bacteriophage,phage）噬菌体的生物学性状噬菌体的生物学性状27四环素（Tet）抑菌剂,与30S结合，阻止编码特异蛋白,修饰细菌膜（5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基因高效导入受体细胞。这些质粒含有两种可供筛选的选择性标记。合成核苷酸，包括胸苷酸ADH（醇脱氢酶）噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。最终导致感染细胞死亡；这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。2补救合成途径：利用细胞内原有的或从胞外吸收的碱基、核苷、核苷酸。松弛型质粒(relaxedplasmid):腺嘌呤核糖脱氨酶（ADA）：严紧型质粒(stringentplasmid)在λ噬菌体DNA分子双链的5’端，各有一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内，会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链DNA分子。这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。（cos:cohensiveendsite)3‘λ噬菌体基因组含50余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对λ噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA片段取代。λ噬菌体上有56种限制性内切酶的识别位点，约300余切点。比如BamHI分别在第5505、22346、27972、34499和41732处有识别位点。λ噬菌体的生长途径λ噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。溶原生长途径是指λ噬菌体的DNA整合在宿主染色体上，随宿主染色体的复制而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。一旦宿主细胞处于某种条件下时，λ噬菌体的DNA脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。溶菌生长是指λ噬菌体在宿主细胞中黏性末端连接，成为环形DNA分子，借用宿主细胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋白，新复制的λDNA与外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。宿主细胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，释放出大量子代λ噬菌体颗粒，感染新的细胞。λ噬菌体的生活史M13噬菌体噬斑单链的M13噬菌体（＋）进入受体菌后，以自身为模板，复制出互补链（－），成为双链的结构，称为复制型DNA。复制型DNA在细胞内可达200个拷贝。此时，（＋）链被特异的蛋白质阻断，不再生成新的（－）链。只能生成新的（＋）链。（＋）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒，挤出宿主细胞。科斯质粒载体（cosmid）粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。又能像λDNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。属松弛型质粒，拷贝数较多。41农杆菌Ti质粒T-DNA两端各有一个25bp的正向重复序列，在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。利用大肠杆菌质粒与T-DNA的部分序列重组，构建Ti质粒克隆载体，可用于植物细胞的基因转移。第三节酵母细胞基因工程载体酵母是最简单的单细胞真核生物。酵母可对表达的多肽链进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、除去N－端的甲硫氨酸等。酵母菌