基因工程目的基因的获取优品文档.ppt

基因工程目的基因的获取第四章目的基因的获取第四章目的基因的获取第一节基因组DNA片断化第一节基因组DNA片断化由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。二、随机片断化1）4bp的内切酶2.机械切割法第二节化学合成目的基因第二节化学合成目的基因①保护dNTP的5’端-OH或3’端P研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。f：fragment大小~20Kb外源DNA片段与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.BAC:容量为300kb内切酶Sau3A进行局部消化。用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！第二节化学合成目的基因提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。固相磷酸三酯合成过程化学合成的DNA片断一般在200bp以内。2.互补延伸连接法1.直接合成基因化学合成法获取目的基因DNA合成仪第三节目的基因的保存和扩增将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。（2）目前常用的载体断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（2）载体与基因组DNA大片段的连接各种酶的接头可以向公司定做或购买。酵母人工染色体基因组文库的构建4.基因组文库的大小例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bp1.cDNA（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤4.构建cDNA文库的一般步骤分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。OligodT纤维柱层析法反转录酶用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。N:A、G、TorC下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。第三节目的基因的保存和扩增在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。N:A、G、TorC酵母人工染色体基因组文库的构建这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。平均每44（256）bp一个切点。与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。酵母人工染色体基因组文库的构建富集特定基因的mRNA或cDNA模板。第三节目的基因的保存和扩增N：所需的重组载体数（克隆数）例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。mRNA在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。6.cDNA文库的大小基因组DNA克隆cDNA克隆三、文库的查询（screening）第四节目的基因的分离和扩增第四节目的基因的分离和扩增纤维柱2.mRNA消解杂交从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。A3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）（2）12种锚定引物（3）5’端的随机引物（4）随机引物与锚定引物成对扩增（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较二、PCR扩增获得目的基因感谢观看