基因工程DNA文库的构建优品文档.ppt

基因工程DNA文库的构建第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选构建基因文库的基本程序：第一节基因组DNA文库的构建鸟枪法（霰弹法）：利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打断，随后通过T4DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，从中获得所要的基因。代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。文库构建策略：①采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段DNA在文库中出现的频率均等；②提高文库所含基因组DNA的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。三、基因组DNA文库构建流程1．基因组DNA文库的载体制备载体的制备要求：①纯度高；②去磷酸化好。2．高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切提取的基因组DNA要求保存完整。分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。3．文库的连接转化或包装侵染在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。4．文库的质量检测文库的平均插入片段长度是通过PFGE电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对BAC文库，一般要求植物的在130kb左右，而动物的在150kb左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是约数）；基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值随机引物引导的cDNA合成是采用6－10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定mRNA并作为反转录的起点。1．自身引导法：首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链，解离的第一链cDNA的3‘-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是与帽子的特殊结构相关），并引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。不易感者特异表达或高表达基因本方法是Okayama和Berg1982提出的。↓去双链结构用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的蛋白质基因合成寡核苷酸：蛋白质N-末端aa序列简并探针实验组mRNA&对照组mRNA生物素标记mRNA：cDNA杂合子原理：SSH是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。①易于转化、便于回收扩增质粒。分别制备探针（mRNA或cDNA)↓分别筛选含目的基因的cDNA文库mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库和其它应用所必需进行的步骤。目前mRNA的纯化方法：在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]链，由它与mRNA的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA，进而将mRNA从其它组分中分离出来。1．mRNA的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力；指导合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和SDS-PAGE）；mRNA的大小（500bp-8kb，多数1.5-2kb）；总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力。3．mRNA的富集3.1按大小对mRNA进行分级分离3.2cDNA的分级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分离大小易辨。3.3多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体。免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo（dT）层析分离mRNA。此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05%。二、cDNA第一链的合成Oligo（dT）引导的cDNA合成是在cDNA的合成过程中加入高浓度的Oligo（dT）引物，Oligo（dT）引物与mRNA的3‘末端的poly（A）配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于cDNA末端