基因工程第七章重组子选择筛选与分析优品文档.ppt

基因工程第七章重组子选择筛选与分析第七章重组子选择、筛选和分析（TheSelection,screeningandanalysisofrecombinants）第一节转基因筛选和选择的方法1．根据载体选择标记初步筛选转化子载体DNA分子上通常携带了一定的选择遗传标记基因，可进行转化子或重组子初步筛选。做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。对于受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。（1）抗药性筛选法（2）插入失活筛选法（3）插入表达筛选法（1）抗药性筛选这是利用载体DNA分子上的抗药性筛选标记进行筛选的方法。主要用于重组质粒DNA分子的转化子筛选。重组质粒DNA分子携带特定的抗药性选择标记基因，在含有相应选择药物的选择培养基上正常生长。①氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）:含bla基因的菌体能转译-丙酰胺酶(-lactarnase)，可降解Ap。②氯霉素(chloramphenicol,Cm或Cmp):含cat基因的菌体能转译氯霉素乙酰转酰酶(chloramphenicolacetyltransferase)，使Cm乙酰化而失效。③卡那霉素(kanamycin,Kn或Kan):含Kan抗性基因菌体转译一种能修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰。四环素(tetracymic,Tc或Tet):含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变细菌膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。⑥链霉素(strentomycin,Sm或Str):含Str抗性基因的菌体转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。某些植物细胞株系（如水稻）对卡那霉素具有一定的抗性，利用卡那霉素筛选NptII基因转化体时假阳性率高，这时可采用Hpt报告基因进行筛选。（3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞精确控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。Prepareplasmidfornextanalysis寡核苷酸探针的核苷酸序列是根据目的蛋白的一小段已知氨基酸序列推导合成出来的，长度一般为10~30bp，甚至可达50bp。优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；Southernblotting1．根据载体选择标记初步筛选转化子cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。用低浓度的DNaseI.当外源DNA片段插入lacZ’基因内时，重组子噬菌斑无色透明，而非重噬菌斑则呈蓝色。[α-32P]dNTPwereincorporatedintothenewlysynthesisedstrand.3)Immunologicalscreeningforexpressedgenes(Westernblotting)Southernblotting：DNA印迹技术用于基因组DNA、质粒和噬菌体的分析。3’UACGAUGCM12345（3）插入表达筛选法插入表达法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。例如pTR262质粒载体，其Tcr基因的上含有一段噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片断插入CI基因的HindIII或BglI位点上时，CI基因失活，Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型，含有外源DNA插入片断的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。2．利用报告基因筛选植物转化细胞在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selectivegene）经常称为报告基因(reportorgene)，常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞①新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II,NPTII）基因新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和G418等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成，进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上-磷酸基团转移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细胞才能存活下来。②潮酶素磷酸转移酶(hyg