基因工程基因工程的载体全套ppt.ppt

基因工程第三章基因工程的载体载体（Vector）基因克隆载体(genecloningvector):能承载外源基因，将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子。载体的功能（FunctionofVector）运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。(1)针对受体细胞的可转移性；(2)自主复制功能；(3)显著的筛选标记；(4)特定的多克隆位点；(5)安全性；载体分类：1）根据构建克隆载体所用的DNA来源分为：质粒载体病毒或噬菌体载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体等。2）根据应用对象分：原核生物克隆载体植物克隆载体动物克隆载体3）按照功能分：克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中1质粒克隆载体2病毒（噬菌体）克隆载体3染色体定位整合克隆载体4人工染色体克隆载体5特殊用途克隆载体1质粒克隆载体质粒载体以质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，含有质粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。质粒组成与构型质粒DNA大小质粒DNA的复制质粒的不亲和型质粒迁移显性质粒和隐蔽质粒质粒组成与构型质粒(plasmid)是一种寓于宿主细胞中染色体外的裸露DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。数量：每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数，少者几个，多者上百个。存在广泛：许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均发现含有质粒。DNA构型：在宿主细胞内，质粒一般以ccc-DNA的形式存在。体外在理化因子作用下，质粒可能成为开环DNA和线形DNA分子。质粒DNA大小质粒DNA分子小的不足2kb，大的可达100kb以上，多数在10kb左右。质粒DNA的复制质粒含有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自我复制。“严紧型”质粒（StringentPlasmid）：低拷贝数，每个宿主细胞仅含1-3份的拷贝。“松弛型”质粒（RelaxedPlasmid）：高拷贝数的，每个宿主细胞可达到10-60份拷贝。质粒的不亲和性（plasmidincompatibility）质粒的不亲和性，也称不相容性:在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存。质粒迁移(PlasmidMobilization)通过接合作用,质粒可以转移到新的宿主细胞中。Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，实现遗传物质的转移。显性质粒和隐蔽质粒显性质粒：也称表达型质粒，质粒携带一些除与自身复制和转移相关的基因外，还有别的基因使得宿主细胞出现新性状。隐蔽质粒：宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表现。1质粒克隆载体(1)能自主复制，即本身是复制子(2)具有多种限制酶的单一切割位点，即多克隆位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；(3)在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。(4)分子量要小，多拷贝，易于操作。；(5)构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要组装各种元件（小DNA片段）。天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。如何识别载体上的各种元件及其功能：大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构农杆菌Ti质粒载体的构建酵母2um质粒克隆载体大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生载体的构建优点：①具有较小的分子量，4363bp。②具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。含有24种单一的限制性内切酶识别位点，且BamHI、SalI和PstI等几个酶切位点分别处于四环素和氨苄青霉素抗性基因上，当将外源DNA片段插入到这些位点时，可用抗生素基因的失活来筛选重组体。③具较高的拷贝数，经过扩增之后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝。pBR322质粒载体的筛选(2)衍生pUC质粒载体iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ'基因；iiii)位于lacZ'基因中的靠近5’--端的一段多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）区段。pUC18-19多克隆位点表达性载体（ExpressionVector）：原核生物表达性载体（ProkaryoticExpressionVector）：pGEXVectorMCSregion：pETVector(StagExpressoinVector):pETVectorMCSregion：真核核生物表达性载体（EukaryoticExpressionVector）：pcDNA3.1VectorMCSregion：pEGFP-C1mammalianExpressionVector:GF