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基因工程实验基因工程实验概述1.PCR特殊的PCR：融合PCR(与SOE-PCR原理一致)：见文献：Shevchuk,N.A.,A.V.Bryksin,etal.(2004)."ConstructionoflongDNAmoleculesusinglongPCR-basedfusionofseveralfragmentssimultaneously."NucleicAcidsRes32(2):12.Szewczyk,E.,T.Nayak,etal.(2006)."FusionPCRandgenetargetinginAspergillusnidulans."Nat.Protoc.1(6):3111-3120.2.巢式PCR目前已经较少用到。3.易错PCR(Error-PronePCR)用于随机突变。通过控制Mg2+和Mn2+的浓度实现。2.DNA/RNA凝胶电泳3.质粒提取4.基因组提取酵母：G418、Zeocin、博莱霉素等。ProDom://protein."FusionPCRandgenetargetinginAspergillusnidulans.DNA酶（DNA外切酶）：用于去除RNA或蛋白质样品中的DNA；分子生物学操作步骤：://protocol-online.将待转化的核酸片段包被于金属颗粒上，直接用于转化。乙酰辅酶A(acetyl-CoA)是细胞内重要的辅因子，参与微生物细胞众多的生化反应。以连接后所得的T载体作为模板，ACS2-F，ACS2-R为引物进行PCR反应，得到如下图所示长片断。OMIM://www3.通过同源重组连接入载体：通过控制Mg2+和Mn2+的浓度实现。常见于毕赤酵母(Pichiapastoris)中，利用pPIC系列整合载体，将要表达的片段整合到染色体上；5.1限制性内切酶5.2连接酶6.怎样把一个基因连接到质粒上？7.怎样把几个片段连接到一起？8.基因敲除8.1构建敲除框8.2转化8.3筛选8.4鉴定基因敲除实例-以LEU2作为筛选标记敲除酿酒酵母ACS2基因5.以连接后所得的T载体作为模板，ACS2-F，ACS2-R为引物进行PCR反应，得到如下图所示长片断。9.过量表达基因过量表达实例-酿酒酵母ACS1/2基因的过量表达表达载体导入受体细胞进行目标基因的过量表达随着发酵的进行细胞内乙酰辅酶A含量的变化情况10.质粒的结构用于基因工程操作的质粒一般具有以下特性：复制起点如果是穿梭载体(Shuttlevector)，还需要具有不同菌株的复制起点，如酵母穿梭载体中的2m片段和相应菌株的CEN-ARS片段。抗性标记多克隆位点(MCS,Multi-CloningSite)为了表达位于其上的基因，一般还需要具有：合适的启动子合适的信号肽序列(可选)相应的终止子为了便于对连接上的基因进行鉴定，通常还有测序引物结合位点：T7，M3……抗性基因多克隆位点(用于连接外源基因)关于蓝白斑筛选Bryksin,etal.AdobeIllustratorCS4+AdobePhotoshopCS4Bryksin,etal.缺点：葡萄糖抑制，半乳糖价格昂贵，无法用于实际生产和大规模的实验以等摩尔的待连接片段为模板，用两端的引物进行PCR，可以得到连接后的PCR片段。锂盐+DTT预处理+山梨醇法。为了表达位于其上的基因，一般还需要具有：Bryksin,etal.怎样把几个片段连接到一起？多克隆位点(MCS,Multi-CloningSite)怎样把一个基因连接到质粒上？使用NcoI限制性内切酶分别处理步骤2，3所得的目标产物，并进行连接反应。HisTag是一串编码组氨酸的序列，使得表达的产物的末端带有6个组氨酸，这6个组氨酸可以形成特定的构向，可以用于：基因名称的含义：://ihop-net.表达载体导入受体细胞进行目标基因的过量表达Marker的大小应根据预计片段的大小进行选择ACS2-R：5’-GCaagcttTTATTTCTTTTTTTGAGAGA-3’关于HisTag启动子大肠杆菌中常用的启动子酵母中常用的启动子11.常用软件12.常用网址蛋白质信息：SwissProt://expasy.hcuge.ch/sprot/sprot-top.htmlENZYME://expasy.ch/sprot/enzyme.htmlOMIM://www3.ncbi.nlm.gov/omim/ProteinDataBank://rcsb.org/模体和结构域数据库：Dali://mercury.ebi.uk/dali/ProDom://protein.toulouse.inra.fr/prodom.htmlPROSITE://expasy.ch/sprot/prosite.html13.常用供应商谢谢！感谢观看