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基因工程诱变定向进化的原理第一节随机诱变一、错误掺入突变易错PCR采用的方法：二、盒式诱变混合寡核苷酸诱变增加聚合酶量到5U，促使在错配碱基处继续延伸反应；该法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，会插入另外3种可用核苷酸的一种；美国Stemmer于1994年首次提出。DNaseI（内切核酸酶活性）DNAshuffling技术是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理或在DNaseI的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成；(randompriminginvitrorecombination，RPR)通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。mutS突变使DNA错配修复系统失去功能；芥子气类——氮芥类、硫芥类HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。（五）双向PCR快速定点诱变三、增变菌株的诱变作用ung-：UDG酶缺陷，UDG酶[尿嘧啶-N-糖基化酶]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。具有较弱的单链内切核酸酶活性；四、化学诱变这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。代表药剂：5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）为胸腺嘧啶（T）的类似物2-氨基嘌呤（AP）为腺嘌呤（A）的类似物马来酰肼（MH）为尿嘧啶（U）的异构体第二节DNA体外重组一、DNA洗牌法（DNAshuffling）二、交错延伸重组（staggeredextensionprocess）三、随机引发重组(randompriminginvitrorecombination，RPR)随机引发合成短DNA片段混合物；过滤并纯化DNA片段混合物；做无引物PCR；用两端引物进行标准PCR，扩增全长的杂交DNA链。第三节寡核苷酸介导的定点诱变70年代初Φx174DNA（ssDNA5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象，即产生带野生型基因组的噬菌体。一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程二、诱变寡核苷酸的设计要求三、经典DNA定点诱变1.背景知识dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由T占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶[尿嘧啶-N-糖基化酶]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+dut+菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。大肠杆菌体内DNA在Dam甲基化酶催化下完全甲基化，对DpnI敏感。它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR样反应中将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂（5sec）复性/延伸反应，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可通过调整反应时间和温度来控制。（三）重叠延伸剪接技术该法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。最后用基因两侧的引物合成全长的基因。增加MgCl2浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对；通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。三、增变菌株的诱变作用使用突变DNA聚合酶，如Mutazyme。（二）重叠延伸PCR诱变(overlappingextensionPCR)DNaseI（内切核酸酶活性）（三）转化子诱变（transformersite-directedmutagenesis）四、PCR介导的定点诱变（一）大引物PCR诱变（二）重叠延伸PCR诱变(overlappingextensionPCR)（三）重叠延伸剪接技术（splicingbyoverlapextension,SOE）五、野生型DNA的筛选和排除第四节嵌套缺失一、外切核酸酶Ⅲ的消化二、BAL31核酸酶消化三、DNaseI消化感谢观看