基因工程获取目的基因专家讲座.pptx
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基因工程获取目的基因专家讲座.pptx
一、目标基因获取一、目标基因获取一、目标基因获取依据:目标基因相关信息。如:依据基因核苷酸序列基因功效基因在染色体上位置基因转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特征2、利用PCR技术扩增目标基因参加组分DNA聚合酶特征①3’DNA分子热变性原理高温处理了打开双链问题,不过,又造成DNA聚合酶失活问题,耐高温TaqDNA聚合酶处理了高温造成DNA聚合酶失活问题,促成了PCR技术自动化。PCR反应条件1、PCR反应步骤950C变性②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间DNA序列,使这段固定长度序列呈指
目的基因的获取专家讲座.pptx
第四章目标基因获取第一节基因组DNA片断化因为带有粘性末端,产物能够直接与载体连接。二、随机片断化1)4bp内切酶2.机械切割法1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因构想,并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因论文。①保护dNTP5’端P或3’端-OH(2)合成过程原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。固相磷酸三酯合成过程化学合成DNA片断普通在200bp以内。2.互补延伸连接法1.直接合成
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基因工程目的基因的获取第四章目的基因的获取第四章目的基因的获取第一节基因组DNA片断化第一节基因组DNA片断化由于带有粘性末端,产物可以直接与载体连接。二、随机片断化1)4bp的内切酶2.机械切割法第二节化学合成目的基因第二节化学合成目的基因①保护dNTP的5’端-OH或3’端P研究某个基因,或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。在测序胶上,每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。f:fragment大小~20Kb外源DNA片段与探针碱基互补的
基因工程实验专家讲座.pptx
基因工程试验试验一:碱裂解法抽提质粒DNA一、试验目标二、试验原理当加入中性缓冲液调和时,变性质粒DNA又恢复到原来构型,而染色体DNA不能复性,它们之间交联形成不溶性网状结构,并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。经过离心沉淀,细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去,而质粒DNA及小分子量RNA则留在上清液中。混杂RNA可用RNaseA消除。再用酚/氯仿处理,可除残留蛋白质三、材料、试剂及仪器3仪器及设备高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、漩涡振荡器培养用试管、量筒、冰盒、微量离