基因工程实验专家讲座.pptx

基因工程试验试验一：碱裂解法抽提质粒DNA一、试验目标二、试验原理当加入中性缓冲液调和时，变性质粒DNA又恢复到原来构型，而染色体DNA不能复性，它们之间交联形成不溶性网状结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。经过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量RNA则留在上清液中。混杂RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿处理，可除残留蛋白质三、材料、试剂及仪器3仪器及设备高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、漩涡振荡器培养用试管、量筒、冰盒、微量离心管、微量取液器、吸管头若干四、试验步骤2质粒DNA提取取1.5ml菌液入1.5ml离心管中5000rpm、离心2min，弃上清，搜集菌体（假如想提取多一点DNA，再吸收1.5ml菌液到同一离心管中，离心，弃上清）:离心时离心管方向要固定，柄朝外，方便看是否离下来用移液枪尽可能除去上清液，然后150uL溶液I悬浮菌体用涡旋振荡器充分振荡：溶液I最好要放冰上加入250uL溶液II，迟缓上下翻转离心管10多下，温和混匀，冰上静置5min：充分裂解菌体加入180uL预冷溶液III，上下翻转十多下，温和混匀，冰上静置10min或者放入-20℃冰箱5min:使染色体DNA等沉淀，而质粒DNA复性1rpm，4℃离心5min。取上清。加2/3体积酚/氯仿1rpm，混匀。1rmp离心5min：用于抽提脂类，蛋白质等。在混匀时，要盖紧盖子，用纸巾包住离心管，往返翻转。离心后会发觉溶液分三层，上层为含DNA，RNA水相，中间为蛋白质，下层为有机相移取上清液，加2倍体积无水乙醇（大量提取时能够用0.6倍异丙醇代替），混匀：用于沉淀DNA，1rpm离心5min，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液枪尽可能除去酒精。用0.5ml70%酒精洗DNA一次，离心2min，倒掉酒精70%酒精能够使DNA保持不溶解状态，30%水还能够使离子洗去离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干十分钟此时DNA变成无色透明加入50ulTE（含50ug/mgRNaseA）溶解DNA沉淀。放置金属浴65℃加热10min或37℃放置数小时使RNaseA发挥作用，而且DNA酶在此条件下会失活-20℃保留备用3质粒DNA深入纯化加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积酚/氯仿，充分振荡：会分三层1rpm，离心5分钟，吸收上清液加入等体积氯仿，1rpm，离心5分钟，取上清加入1/10体积3MNaAc，加2倍体积预冷无水乙醇，混匀。置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至数个小时1rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精用0.5ml70%酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干。加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase）五、试验注意事项3细菌培养后可经过肉眼观察分辨是否有杂菌：大肠杆菌应为乳白色或淡黄色，有杂菌会发红4氯仿有毒性，见光会产生有毒光气，所以要保留于棕色瓶里，任何包括氯仿操作都要在通风厨内使用。而且氯仿会溶解塑料，吸收时把离心管靠近些RNaseA可加入TE中，也可加入SolutionⅠ中加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ摇匀时一定要温和，不能猛烈摇动六、思索题2异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀优缺点答：异丙醇和乙醇都能与与任意百分比水相混合。异丙醇比较疏水，能很更加好地沉淀核酸，乙醇能够去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续试验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适合用于浓度低，而体积大DNA样品沉淀。普通不需要在低温条件下长时间放置。缺点为：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去乙醇是沉淀DNA乙醇是首选有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后试验。在适当盐浓度下，2倍样品容积95％乙醇可有效沉淀DNA。其缺点是总体积较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失3核酸沉淀时为何要加高浓度盐（NaAc）？答：在pH为8为左右溶液中，分子是带负电荷，加一定浓度或，使中和分子上负电荷，降低分子之间同性电荷相斥力，易于相互聚合而形成钠盐沉淀，当加入盐溶液浓度太低时，只有部分形成钠盐而聚合，这么就造成沉淀不完全，当加入盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀中，因为过多盐杂质存在，影响酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀试验二琼脂凝胶电泳一、试验目标二、试验原理三、试验材料、试剂和仪器四、试验步骤2.点样1xTE或ddH2O:7μL10ul混合液10xloadingbuffer:1ul样品:2ul混合后点入点样