用于确定同时结合的基于细胞的FRET测定法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108139394A(43)申请公布日2018.06.08(21)申请号201680058017.X(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所(22)申请日2016.09.2911247代理人史文静黄革生(30)优先权数据15188065.52015.10.02EP(51)Int.Cl.G01N33/542(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日G01N33/544(2006.01)2018.03.30(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2016/0731862016.09.29(87)PCT国际申请的公布数据WO2017/055399EN2017.04.06(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人S·西伯尔J·菲舍尔G·弗尔蒂格权利要求书1页说明书29页序列表23页附图9页(54)发明名称用于确定同时结合的基于细胞的FRET测定法(57)摘要本文报道了测定双特异性抗体与第一和第二抗原同时结合的方法，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET-供体标签的第一抗原和带FRET-接受体标签的第二抗原的细胞与双特异性抗体结合，和b)通过测定从FRET-供体向FRET-接受体的能量转移来测定双特异性抗体的同时结合。CN108139394ACN108139394A权利要求书1/1页1.一种测定双特异性抗体与第一和第二抗原同时结合的方法，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET-供体标签的第一抗原和细胞膜结合的带FRET-接受体标签的第二抗原的细胞与双特异性抗体一起孵育，和b)通过测定从FRET-供体向FRET-接受体的能量转移来测定双特异性抗体的同时结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞膜结合的FRET-供体和所述细胞膜结合的FRET-接受体在N-端至C-端方向上包含：H2N-抗原-FRET-供体/接受体-跨膜结构域-COOH3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述FRET-供体和/或接受体是标签分别和FRET-供体-荧光染料或FRET-接受体-荧光染料的缀合物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述缀合物是非共价缀合物，并且所述FRET-供体-荧光染料和/或所述FRET-接受体-荧光染料是荧光染料缀合的抗体。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述缀合物是共价缀合物，所述标签是酶并且所述FRET-供体-荧光染料和/或所述FRET-接受体-荧光染料是荧光染料标记的自杀酶底物。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中i)所述FRET-供体或FRET-接受体是SNAP-标签和苄基鸟嘌呤的共价复合物，并且ii)所述FRET-接受体或所述FRET-供体是CLIP-标签和O2-苄基胞嘧啶的共价复合物，其中FRET-供体和FRET-接受体是不同的标签。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体包含特异性结合所述第一抗原的一个或两个结合位点和特异性结合所述第二抗原的一个或两个结合位点。8.一种测定双特异性抗体的以较高KD值特异性结合其抗原的结合位点的结合相互作用(强度)的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一结合位点和特异性结合第二抗原的第二结合位点，由此所述两个结合位点以结合亲和力至少10倍的差异结合它们各自的抗原，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET-供体标签的第一抗原和带FRET-接受体标签的第二抗原的细胞与双特异性抗体一起孵育，并通过测定从FRET-供体到FRET-接受体的能量转移来测定双特异性抗体的结合，b)在增加浓度的具有较低KD值的包含双特异性抗体的结合位点的单特异性抗体存在下重复步骤a)，和c)通过测定从FRET-供体向FRET-接受体的能量转移减少时的单特异性抗体的浓度来测定结合相互作用(强度)。2CN108139394A说明书1/29页用于确定同时结合的基于细胞的FRET测定法[0001]本文报道了用于测定双特异性抗体对其靶/抗原两者的同时结合的细胞FRET测定法。背景技术[0002]抗体功能结合的测定是在药物开发中进行的常规测试。[0003]荧光共振能量转移(FRET)是在50多年前首次描述的物理现象。FRET基于从供体分子到接受体分子的无辐射能量转移。因此不需要两种分子的直接接触，即它是依赖于距离的能量转移。因此，FRET可以用来研究分子间的相互作用。[0004]在US2015/024410中，涉及用于测定抗体与存在于测量培养基中的细胞膜或完整细胞中表达的Fc受体的结合的体外方法，其包括以下步骤：(i)用一对FRET配偶体的第一成员直接或间接标记所述Fc受体，或者将预先直接用一对FRET配偶体的第一成员标记Fc受体的细胞膜或完整细胞引