用于GalNAc寡核苷酸缀合物的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110621700A(43)申请公布日2019.12.27(21)申请号201880031623.1(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所1(22)申请日2018.05.221247代理人张建黄革生(30)优先权数据PCT/EP2017/0623182017.05.23EP(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C07H1/00(2006.01)2019.11.13C07H21/00(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据C07H21/02(2006.01)PCT/EP2018/0632642018.05.22(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/215391EN2018.11.29(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人S·布莱特勒J·利尔K·普恩特纳R·特鲁萨迪权利要求书4页说明书48页序列表2页(54)发明名称用于GalNAc寡核苷酸缀合物的方法(57)摘要本发明包含用于制备有治疗价值的GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的方法。该方法包含使寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐与GalNAc聚簇化合物或其盐偶联且随后纯化。CN110621700ACN110621700A权利要求书1/4页1.用于制备GalNAc聚簇寡核苷酸缀合物的方法，其包含下列步骤：a)生产结合至固相支持物的寡核苷酸或其脂族胺盐；b)从支持物上裂解寡核苷酸并且在氨存在下除去保护基，由此得到未保护的寡核苷酸的铵盐；c)将寡核苷酸铵盐进行盐交换改变成寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐，由此除去任意游离氨或残留脂族胺；d)使寡核苷酸的碱金属盐、碱土金属盐或四烷基铵盐与GalNAc聚簇化合物或其盐偶联，且最终e)纯化GalNAc-聚簇寡核苷酸缀合物。2.权利要求1的方法，其中寡核苷酸为5’氨基-修饰的寡核苷酸。3.权利要求2的方法，其中5’氨基-修饰剂选自任选氨基被保护的氨基C2-12-烷基连接基或包含1-10个乙二醇单元的氨基乙二醇连接基。4.权利要求1-3任一项的方法，其中寡核苷酸由任选修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成，并且为7-30个核苷酸长度。5.权利要求1-4任一项的方法，其中寡核苷酸由DNA或LNA核苷单体或其组合组成，并且为10-25个核苷酸长度。6.权利要求1-5任一项的方法，其中在步骤a)中，脂族胺盐为单-、二-或三-C1-4-烷基胺或脂环族胺盐。7.权利要求6的方法，其中形成二乙胺。8.权利要求1-7任一项的方法，其中在步骤b)中，使用氨水。9.权利要求1-8任一项的方法，其中在步骤c)中，形成寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐的水溶液。10.权利要求9的方法，其中从水溶液中分离寡核苷酸的碱金属盐或碱土金属盐a)通过蒸发水且随后借助于适合的有机溶剂共沸除去剩余的水来进行，或b)通过连续部分蒸发(使用恒定体积并且添加水)至蒸气相的pH达到pH7来进行，或c)通过对碱金属盐或碱土金属盐的水溶液的正切流动过滤来进行，或d)通过阴离子交换色谱法、随后脱盐和通过正切流动过滤浓缩来进行。11.权利要求1-10任一项的方法，其中步骤d)中的偶联使用下式的GalNAc聚簇化合物、其相应的盐、对映体和/立体异构体来进行，2CN110621700A权利要求书2/4页其中R2为氢或羟基保护基，且n为0-10的整数。12.权利要求11的方法，其中式I的GalNAc聚簇化合物为式Ia的碱金属或碱土金属盐其中M+/++为碱金属或碱土金属阳离子。13.权利要求1-12任一项的方法，其中步骤d)中寡核苷酸与GalNAc聚簇化合物或其盐的偶联包括在第一步中用偶联剂活化GalNAc聚簇化合物，并且在第二步中使活化的GalNAc聚簇化合物与寡核苷酸在胺碱和有机溶剂存在下偶联。14.权利要求13的方法，其中偶联剂为选自如下的偶联剂：DCC(N，N′-二环己基碳二亚胺)或EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N`-乙基碳二亚胺-盐酸盐)或TBTU(N，N，N′，N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)；且添加剂选自HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其组合。15.权利要求13或14的方法，其中胺碱为叔胺，有机溶剂为极性无质子溶剂，且反应温3CN110621700A权利要求书3/4页度在20℃-70℃的范围。16.权利要求13的方法，其中偶联剂为正丙基膦酸酸酐(T3P)或(3-(二乙氧基-磷酰基氧基)-1，2，3-苯并[d]三嗪-4(3H)