用于产生胸腺细胞上清液的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110621773A(43)申请公布日2019.12.27(21)申请号201880032716.6(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所(22)申请日2018.05.1611247代理人胡志君黄革生(30)优先权数据17171903.22017.05.19EP(51)Int.Cl.C12N5/0781(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2019.11.18(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2018/0626472018.05.16(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/210896EN2018.11.22(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人S·奥夫纳M·霍瓦特I·萨姆权利要求书1页说明书29页附图1页(54)发明名称用于产生胸腺细胞上清液的方法(57)摘要本文中报道了一种用于产生胸腺细胞上清液的方法，所述方法包括步骤：将至少0.5:1.2细胞比率的胸腺细胞和单个核细胞在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯和植物凝集素M存在下共培养多达60小时，以及将共培养培养基与细胞分离并因而产生胸腺细胞上清液。CN110621773ACN110621773A权利要求书1/1页1.一种用于产生胸腺细胞上清液的方法，包括以下步骤：-将胸腺细胞和单个核细胞以0.5:1.2或更大的细胞比率在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯和植物凝集素M存在下共培养多达60小时，和-将共培养培养基与细胞分离并因而产生胸腺细胞上清液。2.根据权利要求1所述的方法，其中胸腺细胞/单个核细胞比率是0.5:1.25至0.5:4。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中比率是约0.5:2。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中胸腺细胞的细胞密度在共培养时是约5x105个细胞/ml。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在共培养之前，将胸腺细胞在37℃在培养基中温育多达60小时。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过以2x106个细胞/ml的细胞密度贴附于固体表面，从PBMC分离单个核细胞并且将贴壁的单个核细胞在培养基中温育约40小时，之后与胸腺细胞共培养。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在共培养胸腺细胞和单个核细胞之前，将胸腺细胞的培养基替换为含有10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和5μg/ml植物凝集素M(PHA-M)的新鲜培养基。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过从单个核细胞移除培养基并添加胸腺细胞悬液，启动共培养。9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中培养基是RPMI培养基，所述RPMI培养基补充有10％(v/v)FCS、1％(w/v)包含青霉素和链霉素的200mM谷氨酰胺溶液、2％(v/v)100mM丙酮酸钠溶液和1％(v/v)1M2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙磺酸(HEPES)缓冲液，还包含0.05μMβ-巯基乙醇。10.用于共培养一种或多种B细胞的方法，包括步骤-将一种或多种B细胞与EL4-B5细胞在用根据权利要求1至9中任一项所述方法产生的TSN存在下共培养。11.胸腺细胞上清液，其用根据权利要求1至9中任一项所述方法产生。12.用根据权利要求1至9中任一项所述方法产生的胸腺细胞上清液的用途，用于共培养B细胞和饲养细胞。2CN110621773A说明书1/29页用于产生胸腺细胞上清液的方法[0001]本文中报告了用于产生胸腺细胞上清液的改良方法。这种上清液可以例如用在共培养沉淀的单一B细胞或B细胞与饲养细胞的汇集物中。[0002]发明背景[0003]为了获得分泌单克隆抗体的细胞，广泛使用Koehler和Milstein开发的杂交瘤技术。但是在杂交瘤技术中，从免疫接种的实验动物获得的仅部分B细胞可以融合并增殖。B细胞的来源通常是免疫接种的实验动物的器官如脾。[0004]在1984年Zubler等人开始开发获得分泌单克隆抗体的细胞的不同方法(参见，例如Eur.J.Immunol.14(1984)357-63；J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。其中，B细胞从免疫接种的实验动物的血液获得并且与鼠EL-4B5饲养细胞在包含细胞因子的饲养混合物存在下共培养。[0005]Kwekkeboom,J.等人(J.Immunol.Meth.160(1993)117-127)报告了基于用鼠胸腺瘤细胞系活化人B淋巴细胞，产生人单克隆抗体的高效方法。报告了对于人B细胞，培养条件应当是在PMA(5ng/ml)加5％T细胞上清液存在下采用照射过的EL4B5。[0006]Weitkamp,J-H.等人(J.Immunol.