一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110669759A(43)申请公布日2020.01.10(21)申请号201911032173.0(22)申请日2019.10.28(71)申请人北京百迈客生物科技有限公司地址101300北京市顺义区南法信镇顺平路南法信段9号院1幢5层508室(72)发明人郑洪坤毕经德骆晨宋雅丽王瑞(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人商秀玲(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图3页(54)发明名称一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取方法(57)摘要本发明涉及高通量DNA测序技术领域，具体涉及一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取方法。本发明提供一种真菌长片段基因组DNA的提取方法，采用裂解液对真菌细胞进行裂解，依次加入RNA酶和蛋白酶进行消化处理后，采用离子交换柱吸附基因组DNA，经磁珠纯化得到基因组DNA。该方法提取得到的真菌基因组DNA的得率高、纯度高，片段长度长，可以满足纳米孔测序技术对于基因组DNA的质量要求，还具有成本低廉、操作步骤简单、提取耗时短等优势，适用于大量真菌样本的基因组测序。CN110669759ACN110669759A权利要求书1/1页1.一种真菌长片段基因组DNA的提取方法，其特征在于，采用裂解液对真菌细胞进行裂解后，依次进行RNA酶消化处理和蛋白酶K消化处理后，采用离子交换柱吸附基因组DNA，经磁珠纯化得到基因组DNA。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述离子交换柱为以DEAE作为功能基团的阴离子交换树脂纯化柱。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述采用离子交换柱吸附基因组DNA包括：分离经蛋白酶K消化处理后的上清，加入所述离子交换柱中，使所述上清中的液体依靠重力作用自然流出，加入洗涤液进行洗涤后，再加入洗脱液洗脱。4.根据权利要求1～3任一项所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液包含溶壁酶，所述溶壁酶的浓度为90U/mL～110U/mL。5.根据权利要求1～4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液还包含如下组分：盐酸胍0.6～1M、乙二胺四乙酸二钠二水合物20～40mM、三羟甲基氨基甲烷20～40mM、Tween-20体积百分含量3～6％、TritonX-100体积百分含量0.3～0.6％；优选地，所述裂解为在37℃处理1～1.5h。6.根据权利要求1～5任一项所述的提取方法，其特征在于，所述RNA酶消化处理中，RNA酶的添加量为至浓度为0.5～0.8mg/mL；所述RNA酶消化处理为在37℃处理30～45min。7.根据权利要求1～6任一项所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白酶K消化处理中，蛋白酶K的添加量为至浓度为1～1.5mg/mL；所述蛋白酶K消化处理为在50℃处理1.5～2.5h。8.根据权利要求3～7任一项所述的提取方法，其特征在于，将所述洗脱获得的溶液进行基因组DNA的沉淀；优选地，采用异丙醇沉淀基因组DNA，用乙醇洗涤沉淀后再进行溶解。9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述磁珠纯化为在所述溶解得到的基因组DNA溶液中加入磁珠，采用乙醇洗涤磁珠，纯化基因组DNA。10.权利要求1～9任一项所述的真菌长片段基因组DNA的提取方法在基因组测序文库构建中的应用；优选地，所述文库为用于纳米孔测序的文库。2CN110669759A说明书1/7页一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取方法技术领域[0001]本发明涉及高通量DNA测序技术领域，具体涉及一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取方法。背景技术[0002]随着高通量测序技术的发展，Long-read(长读长)测序技术愈发受到科学界的青睐，纳米孔测序平台如Oxfordnanopore公司的MinION、GridION和PromethION测序仪均在最前沿的基因测序领域如基因组denovo、变异检测、转录组、表观遗传、临床应用中均扮演着重要的角色。而这些纳米孔测序平台因为测序读长长的原因，也对基因组DNA提取提出了更高的要求。研究人员不仅要保证基因组DNA的得率和纯度，还需要获得更完整的高分子量的基因组DNA以满足下游纳米孔测序技术的需求，从而在基础科研及医学应用上获得更可靠的技术支持。[0003]真菌细胞壁是真菌特有的一种细胞结构。真菌细胞壁干重的80％由碳水化合物组成，如：几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、纤维素、半乳聚糖等。真菌细胞壁干重的大约10％由蛋白质及糖蛋白构成，蛋白质包括负责细胞壁生长的酶、特定胞外酶和将多糖交联起来的结构蛋白。此外，真菌细胞壁