一种病毒RNA快速提取的方法和试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112626067A(43)申请公布日2021.04.09(21)申请号202110199909.4(22)申请日2021.02.23(71)申请人苏州易迈吉生物医药科技有限公司地址215143江苏省苏州市相城区黄埭镇安民路6号(72)发明人贾萌萌潘韵芝朱国强(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称一种病毒RNA快速提取的方法和试剂盒(57)摘要本发明公开了一种快速从各种来源的样本中提取病毒RNA的方法。由于病毒RNA样本中含量少，不稳定，对病毒RNA分子诊断的准确性造成干扰。本发明中的裂解液能够快速裂解样本并保持病毒RNA的稳定，提取效率高，可以稳定提取样本中及其微量RNA，并且操作简便快速，磁珠的应用可大大提高实验通量，可用于病毒RNA提取的自动化应用。CN112626067ACN112626067A权利要求书1/1页1.一种病毒RNA快速高效提取试剂盒，其特征在于：由以下三种溶液组成：(1)RNA病毒样本快速裂解结合液：为醋酸钠、吐温80、盐酸胍、NaCl和异丙醇的混合溶液，混合溶液中醋酸钠的浓度为50‑500mM之间，优选浓度为200mM；吐温80的体积比为0.1‑1%之间，优选质量浓度为0.2‑0.5%之间；NaCl的浓度为20‑600mM之间，优选浓度为50‑200mM之间；盐酸胍的浓度为2‑8M之间，优选浓度为3‑4M之间；异丙醇的浓度为20‑80vt%之间，优选体积比为30‑50vt%之间；(2)RNA漂洗液：为NaCl和乙醇的混合物，其中，乙醇的浓度为65‑85vt%之间，优选浓度为75‑80vt%之间；NaCl的浓度为20‑200mM之间，优选浓度为50‑100mM之间；(3)RNA洗脱液：5mM的Tris‑HCl缓冲液，pH值8.0‑8.5。2.一种通过权利要求1所述的病毒RNA提取的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)转移150‑300µL抗凝血液/血浆/淋巴液/唾液/肺泡灌洗液/拭子保存液等液体样品至1.5ml离心管，振荡混匀；(2)向样品中加入250µLRNA病毒样本裂解结合液，10µLcarrierRNA，10µL的市售磁珠溶液和125µL异丙醇；(3)颠倒混匀15次，震荡30s，90度温育2min；(4)离心管置于磁力架上，磁珠完全吸附后，弃去上清；(5)将(4)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管或者96孔板取下磁力架，加入600µLRNA漂洗液，涡旋振荡混匀；(6)将(5)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置30s，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管或者96孔板取下磁力架，室温放置30s；(7)向(6)中的EP管或者96孔板加入70μLRNA洗脱液，静置1min，涡旋振荡混匀；(8)将(7)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置30s，等磁珠全部吸附后，用移液枪吸取全部上清，磁珠弃去。2CN112626067A说明书1/4页一种病毒RNA快速提取的方法和试剂盒[0001]技术领域[0002]本发明属于RNA提取技术领域，具体涉及一种病毒RNA快速提取试剂盒及提取方法。背景技术[0003]RNA病毒作为感染性疾病重要的病原之一，其检测对于临床治疗有重要的意义。在临床上病毒核酸检测可作为病毒感染重要的参考依据，而病毒的核酸提取是首要工作。然而由于RNase酶广泛存在，在提取的过程中，RNA病毒核酸极易降解，导致其在检测会出现假阴性的现象。[0004]目前针对RNA病毒的核酸提取，需要加入蛋白酶K辅助裂解，蛋白酶K长期保存需要低温，常温或者高于常温条件下蛋白酶K存在不稳定，并且需要多次漂洗，操作步骤复杂，时间过长，无法进行病毒样本的快速提取和现场检测。[0005]硅基质膜吸附法的缺点在于需要反复离心，倾倒废液；操作繁琐和耗时长，在处理多个样本的时候容易交叉污染；由于样本是单管独立处理，难以形成自动化操作，满足不了临床高通量检测的需求。[0006]而除此之外，TRIzol法中使用的重蒸酚和氯仿是有机溶剂，具有毒性；而普通的水煮法无法直接用于提取RNA，主要是因为样品中存在内源性的RNA酶，而这些RNA酶会将RNA降解。因此，在病毒RNA的检测领域尤其是大规模流行性RNA病毒的检测和筛查，需要一种快速简便易操作，效果稳定，病毒RNA提取效率高的方法和试剂盒。[0007]由于可以用于自动化仪器，磁珠法核酸提取方法在病原体临床检测上应用越来越广泛，主要原理是基于磁珠在高盐和异丙醇混合Buffer中对病毒RNA进行特异性的吸附，然后经过RNA漂洗液Buffer分离和漂洗蛋白质和多糖