在真核宿主细胞中产生多聚体蛋白质的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113330027A(43)申请公布日2021.08.31(21)申请号202080010293.5(74)专利代理机构北京坤瑞律师事务所11494(22)申请日2020.01.22代理人岑晓东(30)优先权数据(51)Int.Cl.62/796,0142019.01.23USC07K16/00(2006.01)C07K16/46(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2021.07.21(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2020/0146232020.01.22(87)PCT国际申请的公布数据WO2020/154410EN2020.07.30(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人L·C·西蒙斯N·布兰科·塔拉万权利要求书10页说明书46页序列表6页附图31页(54)发明名称在真核宿主细胞中产生多聚体蛋白质的方法(57)摘要本公开涉及在真核宿主细胞中产生多聚体多肽(例如，包含两个或更多个亚基，每个亚基包含两条或更多条多肽链，诸如多特异性或双特异性抗体)。在一些实施例中，本文提供使用包含多核苷酸的宿主细胞在真核宿主细胞中产生多聚体多肽的方法，所述多核苷酸包含与编码所述多聚体多肽的每个多肽的开放阅读框可操作地连接的翻译起始序列。有利地，本公开证明了调节与每个开放阅读框连接的翻译起始序列的强度允许以在更少错误组装的副产物的情况下多聚体多肽的更高产量。本公开进一步提供与其相关的细胞、筛选方法和试剂盒。CN113330027ACN113330027A权利要求书1/10页1.一种在真核宿主细胞中产生多聚体多肽的方法，其中所述多聚体多肽包含包括第一多肽链和第二多肽链的第一亚基以及包括第三多肽链和第四多肽链的第二亚基，所述方法包括：(a)提供所述真核宿主细胞，其中所述真核宿主细胞包含第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三核苷酸和第四多核苷酸，所述第一多核苷酸包含与编码所述第一多肽链的第一开放阅读框可操作地连接的第一翻译起始序列，所述第二多核苷酸包含与编码所述第二多肽链的第二开放阅读框可操作地连接的第二翻译起始序列，所述第三多核苷酸包含与编码所述第三多肽链的第三开放阅读框可操作地连接的第三翻译起始序列，所述第四多核苷酸包含与编码所述第四多肽链的第四开放阅读框可操作地连接的第四翻译起始序列，其中当每个亚基在所述真核宿主细胞中单独被表达时，所述第一亚基以低于所述第二亚基的水平被表达，并且其中所述第一翻译起始序列和所述第二翻译起始序列中的一者或两者弱于所述第三翻译起始序列和所述第四翻译起始序列中的一者或两者；(b)在适合于所述第一多肽链、所述第二多肽链、所述第三多肽链和所述第四多肽链的表达的条件下培养所述真核宿主细胞，其中一经表达所述第一多肽链、所述第二多肽链、所述第三多肽链和所述第四多肽链形成所述多聚体多肽；以及(c)回收由所述真核宿主细胞产生的所述多聚体多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中当所有亚基在同一宿主细胞中被表达时，所述第一亚基的一条或两条多肽链以低于所述第二亚基的一条或两条多肽链的水平被表达。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所有所述第一翻译起始序列、所述第二翻译起始序列、所述第三翻译起始序列和所述第四翻译起始序列均包含序列(从5'到3')NNNNNATGNGA，其中N为C、G、A或T/U(SEQIDNO:1)。4.根据权利要求1‑3中任一项所述的方法，其中所述第一翻译起始序列和所述第二翻译起始序列中的一者或两者包含选自由SEQIDNO:8‑10组成的组的序列。5.根据权利要求1‑4中任一项所述的方法，其中所述第三翻译起始序列和所述第四翻译起始序列中的一者或两者包含序列ACCATGG(SEQIDNO:3)或GAAGTATGA(SEQIDNO:11)。6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一翻译起始序列包含SEQIDNO:9的序列，其中所述第二翻译起始序列包含SEQIDNO:9的序列，其中所述第三翻译起始序列包含SEQIDNO:2的序列，并且其中所述第四翻译起始序列包含SEQIDNO:11的序列。7.根据权利要求1‑6中任一项所述的方法，其中所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸、所述第三多核苷酸和所述第四多核苷酸中的每一者与启动子可操作地连接。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸与同一启动子可操作地连接，并且其中所述第三多核苷酸和所述第四多核苷酸与同一启动子可操作地连接。9.根据权利要求1‑8中任一项所述的方法，其中所述第一翻译起始序列弱于所述第三翻译起始序列。10.根据权利要求1‑9中任一项所述的方法，其中所述第二翻译起始序列弱于所述第四2CN11333002