在原核宿主细胞中产生双链蛋白质的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113260626A(43)申请公布日2021.08.13(21)申请号201980086175.X(74)专利代理机构北京坤瑞律师事务所11494(22)申请日2019.11.04代理人岑晓东(30)优先权数据(51)Int.Cl.62/755,9152018.11.05USC07K16/00(2006.01)C07K16/24(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12N9/90(2006.01)2021.06.24C12N15/70(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2019/0596612019.11.04(87)PCT国际申请的公布数据WO2020/096959EN2020.05.14(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人K·维拉瓦利R·麦肯纳权利要求书7页说明书52页序列表4页附图18页(54)发明名称在原核宿主细胞中产生双链蛋白质的方法(57)摘要本文提供了用于产生含有两条链的多肽诸如抗体、半抗体、抗体片段或单臂抗体的方法和宿主细胞。所述方法和宿主细胞允许使用以下方式来产生双链多肽：表达编码来自染色体外多核苷酸的多肽链的多核苷酸，以及使用启动子和编码伴侣蛋白质的翻译单元的非天然组合来表达一种或多种来自宿主细胞染色体的伴侣蛋白质(例如，肽基脯氨酰异构酶和/或蛋白质二硫键氧化还原酶)。CN113260626ACN113260626A权利要求书1/7页1.一种在包含宿主细胞染色体的原核宿主细胞中产生包含两条链的多肽的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述多肽的两条链的条件下在培养基中培养所述宿主细胞以表达所述多肽的两条链，从而在表达后所述两条链即折叠并组装以在所述宿主细胞中形成生物活性多肽；其中所述宿主细胞包含：(1)第一多核苷酸，其包含编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)第二多核苷酸，其包含编码所述多肽的第二链的第二翻译单元，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是一个或多个染色体外多核苷酸的一部分；以及(3)第三多核苷酸，其包含编码伴侣蛋白质的第三翻译单元，所述伴侣蛋白质选自由肽基脯氨酰异构酶和蛋白质二硫键氧化还原酶组成的组，其中所述第三翻译单元是所述宿主细胞染色体的一部分，其中所述第三翻译单元与整合在所述宿主细胞染色体中并驱动所述第三翻译单元转录的启动子可操作地组合，并且其中所述第三翻译单元和所述启动子的组合对于所述宿主细胞染色体是非天然的；以及(b)从所述宿主细胞中回收所述生物活性多肽。2.根据权利要求0所述的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。3.根据权利要求0所述的方法，其中所述诱导型启动子是当所述培养基中的磷酸盐耗尽时驱动所述第三翻译单元转录的Pho启动子。4.根据权利要求0所述的方法，其中所述诱导型启动子是当IPTG存在于所述培养基中时驱动所述第三翻译单元转录的异丙基β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子。5.根据权利要求0所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子。6.根据权利要求0所述的方法，其中所述组成型启动子是CP25启动子。7.根据权利要求0‑0中任一项所述的方法，其中所述第三翻译单元对于所述宿主细胞染色体是天然的。8.根据权利要求0‑0中任一项所述的方法，其中所述第三翻译单元对于所述宿主细胞染色体是非天然的。9.根据权利要求0‑0中任一项所述的方法，其中所述伴侣蛋白质是肽基脯氨酰异构酶。10.根据权利要求0所述的方法，其中所述肽基脯氨酰异构酶是FkpA蛋白质。11.根据权利要求0所述的方法，其中所述FkpA是大肠杆菌FkpA。12.根据权利要求0‑0中任一项所述的方法，其中所述伴侣蛋白质是蛋白质二硫键氧化还原酶。13.根据权利要求0所述的方法，其中所述蛋白质二硫键氧化还原酶是DsbC蛋白质。14.根据权利要求0所述的方法，其中所述蛋白质二硫键氧化还原酶是大肠杆菌DsbC。15.根据权利要求0所述的方法，其中所述蛋白质二硫键氧化还原酶是DsbA蛋白质。16.根据权利要求0所述的方法，其中所述蛋白质二硫键氧化还原酶是大肠杆菌DsbA。17.一种在包含宿主细胞染色体的原核宿主细胞中产生包含两条链的多肽的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述多肽的两条链的条件下在培养基中培养所述宿主细胞以表达所述多肽的两条链，从而在表达后所述两条链即折叠并组装以在所述宿主细胞中形成生物活2CN113260626A权利要求书2/7页性多肽；其中所述宿主细胞包含：(1)第一多核苷酸，其包含编码所述多肽的第一链的第一翻译单元；(2)第二多核苷酸，其包含编码所述多肽的第二链的第二翻译单元，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是一个或多个染色体外多核苷酸的一部分；