一种用于检测JPH3基因的引物对、试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114182006A(43)申请公布日2022.03.15(21)申请号202111473314.X(22)申请日2021.12.02(71)申请人迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司地址400026重庆市江北区港城东环路6号1幢1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2(72)发明人伍建姬晓雯武璇(74)专利代理机构北京星通盈泰知识产权代理有限公司11952代理人葛战波(51)Int.Cl.C12Q1/6883(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书5页附图1页(54)发明名称一种用于检测JPH3基因的引物对、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测JPH3基因的引物对、试剂盒及检测方法；引物对的正向引物的5’端和反向引物的5’端中的至少一端由荧光基团标记，引物对序列：JPH3‑famF：GGCAGAGCCGGGGCCGG；JPH3‑R：GGTTCCCTGCACAGAAACCATC；本发明方法通过提取DNA并利用上述引物对进行PCR扩增，对PCR扩增后的产物进行毛细管电泳，分析JPH3基因CTG重复序列情况，得出JPH3基因CTG重复数，对HDL2进行评估，整个检测过程耗时短、效率高。CN114182006ACN114182006A权利要求书1/2页1.一种用于检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物的5’端和反向引物的5’端中的至少一端由荧光基团标记，所述引物对序列如下：JPH3‑famF：GGCAGAGCCGGGGCCGG；JPH3‑R：GGTTCCCTGCACAGAAACCATC。2.根据权利要求1所述用于检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的引物对，其特征在于，所述引物对famF向引物5’端带5’‑FAM荧光基团。3.一种用于检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对。4.根据权利要求3所述用于检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括25体积份的2xGoldStarBestMasterMix、2.4体积份的DMSO、13.6体积份的无核酸酶纯化水和4体积份权利要求1所述的引物对。5.一种检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的非诊断目的的检测方法，其特征在于，包括：1)提取DNA并利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；2)对所述步骤1)PCR扩增后的产物进行毛细管电泳；3)分析JPH3基因中CTG重复情况。6.根据权利要求5所述检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增包括：按DNA检测样本数量配置扩增反应液混合液，所述扩增反应液混合液中：2×GoldStarBestMasterMix试剂用量25×nμl；10uM的JPH3‑famF引物用量2×nμl；10uM的JPH3‑R引物用量2×nμl；DMSO用量2.4×nμl；ddH2O用量13.6×nμl；所述n＝检测样本数+1；按45ul扩增反应混合液中加入5ulDNA；进行PCR扩增。7.根据权利要求6所述检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增包括：在PCR仪中先以95℃变性1分钟；再运行35次如下循环：94℃变性30秒、59℃退火30秒、72℃延伸1分钟；之后72℃延伸5分钟，4℃保存。8.根据权利要求5所述检测JPH3基因CTG重复序列动态突变的非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述步骤2)对所述步骤1)PCR扩增后的产物进行毛细管电泳包括：对PCR扩增产物进行稀释，在ddH2O中加入PCR扩增产物；取ABIGS500‑LIZ内标和HIDI按1∶250的体积比混合后，取混合液与稀释后的PCR扩增产物混合制成上机混合液；将配置好的上机混合液在PCR仪上以95℃运行3分钟后，冰水混合物中冷却5分钟，温度为0℃，作变性处理；上机混合液在ABI3730xl测序仪中进行检测，采用G5颜色分组，在ABI3730xl测序仪中的分型参数设置如下：检测恒温OVEN_Temperature60℃，缓冲液温度Buffer_Temperature35℃；预电泳电压PreRun_Voltage15kV，预电泳时间PreRun_Time180s；注入电压Injection_Voltage为1.5kV；注入时间Injection_Time为15s；第一次读数First_ReadOut_Time300ms；第二次读数Second_ReadOut_Time300ms；电泳电压Ru