一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108531603A(43)申请公布日2018.09.14(21)申请号201810547315.6(22)申请日2018.05.31(71)申请人青岛普泽麦迪生物技术有限公司地址266071山东省青岛市市北区山东路171号青岛科技创新大厦610室(72)发明人姚斐宫小明(74)专利代理机构青岛清泰联信知识产权代理有限公司37256代理人张洁(51)Int.Cl.C12Q1/6886(2018.01)C12Q1/6806(2018.01)C12Q1/6869(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表1页附图2页(54)发明名称一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明提出一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法，属于生物医学临床分子检测领域，能够在BRAFV600E突变检测中消除野生型DNA，仅留下突变的BRAFV600EDNA，从而在PCR过程中突变信号放大，可有效减少假阴性结果、提高检测准确性。该引物对包括如SEQNo.1序列所示的上游引物和如SEQNo.2序列所示的下游引物。本发明能够应用于BRAFV600E(1799T>A)基因突变检测中突变信号的放大中。CN108531603ACN108531603A权利要求书1/2页1.一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对，其特征在于，包括如SEQNo.1序列所示的上游引物和如SEQNo.2序列所示的下游引物。2.一种用于BRAF基因V600E突变检测的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所示的引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有所述引物对的第二试剂盒以及含有与所述引物对配合使用的探针的第一试剂盒，其中，所述探针包括如SEQNo.3序列所示的正义探针和如SEQNo.4序列所示的反义探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂盒还包括PCR反应管、去离子水、DSN缓冲液和未用DSN处理的阴性对照品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第二试剂盒还包括PCR反应管、DSN处理后的DNA样品和未用DSN处理的阴性DNA对照品、PhusionHF缓冲液、去离子水、dNTP和聚合酶。6.一种利用权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行BRAF基因V600E突变检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：将模板DNA、正义探针和反义探针加入第一试剂盒中的PCR管中进行PCR反应，具体包括在98℃下反应2min，待模板DNA变性后，将温度降至67℃，同时加入1个单位的DSN的缓冲液，混匀后在67℃反应20min后，将温度升高至95℃继续反应20min使DSN失活，得到DSN缓冲液处理后的DNA样品；同时，建立不加入1个单位的DSN缓冲液的阴性DNA对照品；将DSN缓冲液处理后的DNA样品或阴性DNA对照品、引物对、PhusionHF缓冲液、去离子水、dNTP和聚合酶加入第二试剂盒中的PCR管中进行聚合酶链反应，分别得到聚合酶链产物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用所述第一试剂盒进行PCR反应时，各反应物具体加入以下体积，共计10μl：8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用所述第二试剂盒进行聚合酶链反应时，各反应物具体加入以下体积，共计25μl：2CN108531603A权利要求书2/2页聚合酶链反应的条件为：98℃反应2min,随后以98℃10sec,58℃20sec和72℃10sec循环45次，最后在72℃反应5min。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括利用PCR纯化试剂盒对所得到的聚合酶链产物分别进行纯化，然后利用桑格序列对其进行分别测序的步骤。10.一种如权利要求1所述的引物对和权利要求2-5任一项所述的试剂盒在BRAF基因V600E突变检测中对突变信号进行放大中的应用。3CN108531603A说明书1/5页一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法技术领域[0001]本发明属于生物医学临床分子检测领域，尤其涉及一种用于BRAF基因V600E突变检测的引物对、试剂盒及其检测方法。背景技术[0002]BRAF为一种鸟苷酸结合蛋白RAS活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在调节有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中发挥重要作用，是最重要的原癌基因之一。MAPK信号通路可正常调节细胞生长、分裂和分化,也可因RAF家族成员致癌性突变体的形成而引发癌症。其中BRAFV600突变体的产生显著增强了BRAF的活性,从而导致癌细胞分裂失控,大约8％的人类肿瘤发生BRAF突变。BRAF绝大部分突变形式