用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114381510A(43)申请公布日2022.04.22(21)申请号202111625449.3(22)申请日2021.12.28(71)申请人迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司地址400026重庆市江北区港城东环路6号1幢1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2(72)发明人伍建姬晓雯武璇(74)专利代理机构北京星通盈泰知识产权代理有限公司11952代理人葛战波(51)Int.Cl.C12Q1/6883(2018.01)C12Q1/6869(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书18页序列表1页(54)发明名称用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法(57)摘要本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法；包括提取cfDNA样本，基于提取的cfDNA样本，配置用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增，对扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序，采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到cfDNA样本的BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关信息，本发明可对BRAF基因第12外显子检出含0.09％的BRAF基因相关位点突变的游离核酸样本，对第15外显子检出含0.05％的BRAF基因相关位点突变的游离核酸样本，可提高BRAF基因相关位点生物临床检测水平，为普及应用奠定基础。CN114381510ACN114381510A权利要求书1/2页1.一种用于检测BRAF基因突变的引物组合，其特征在于，包括用于检测BRAF基因第12个外显子和/或第15个外显子的特异性引物，所述用于检测BRAF基因第12个外显子的特异性引物为：Exon12‑F：GGTGATGTGGCAGTGAAAATGT，Exon12‑R：ACTCCTACTTCATTTTTGAAGGCT；所述用于检测BRAF基因第15个外显子的特异性引物为：Exon15‑F：CACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT，Exon15‑R：TCAAACTGATGGGACCCACTC。2.一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述用于检测BRAF基因突变的引物组合。3.如权利要求2所述用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，包括用于第一次PCR扩增的试剂盒和用于第二次PCR扩增的试剂盒；所述用于第一次PCR扩增的试剂盒包括权利要求1所述用于检测BRAF基因突变的引物组合和2×KAPAHiFiHotstartReadyMix；所述用于第二次PCR扩增的试剂盒包括2×KAPAHiFiHotstartReadyMix、PE1.0和Barcode。4.一种用于检测BRAF基因突变的反应体系，其特征在于，包括用于第一次PCR扩增的反应体系和用于第二次PCR扩增的反应体系；所述用于第一次PCR扩增的反应体系包括：25体积份的2×KAPAHiFiHotstartReadyMix、3体积份的权利要求1所述用于检测BRAF基因第12个号显子和/或第15个号显子的特异性引物和22体积份的游离核酸样本；所述用于第二次PCR扩增的反应体系包括：25体积份的2×KAPAHiFiHotstartReadyMix、1体积份的PE1.0、1体积份的Barcode和23体积份的第一次PCR扩增后纯化DNA产物。5.一种构建检测BRAF基因突变模型的方法，其特征在于，包括：1)、提取cfDNA样本；2)、基于提取的cfDNA样本，配置权利要求4所述用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增；3)、对所述步骤2)扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对所述测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序；4)、采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到所述cfDNA样本的BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关信息，构建所述检测BRAF基因突变模型。6.如权利要求5所述构建检测BRAF基因突变模型的方法，其特征在于，BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点包括：所述BRAF基因第12号外显子特定位点为：c.1459_1473del:p.V487_T491del和/或c.1458_1472del:p.N486_T491delinsK和/或c.1457_1471del:p.N486_P490del和/或c.1455_1469del:p.L485_P490delinsF；所述BRAF基因第12号外显子特定位点为：c.1799_1800delinsAT: