用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114350778A(43)申请公布日2022.04.15(21)申请号202111529140.4(22)申请日2021.12.14(71)申请人迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司地址400026重庆市江北区港城东环路6号1幢1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2(72)发明人伍建姬晓雯武璇(74)专利代理机构北京星通盈泰知识产权代理有限公司11952代理人葛战波(51)Int.Cl.C12Q1/6883(2018.01)C12Q1/6869(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图1页(54)发明名称用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法，引物对为引物对M4或引物对M5，引物对M4为：M4‑F：AAGTGAACTGTATCCGACATCTGGTTCC，M4‑R：TAGCTACCCCCAAGTGTTATGGGC；引物对M5为：M5‑F：ATAAAGCCTAAATAGCCCACACGTTCC，M5‑R：GACCCTGAAGTAGGAACCAGATGTCG，本发明方法通过提取DNA，利用引物对对mtDNA进行长片段扩增，对扩增的产物进行片段化、末端修复、连接接头、纯化和PCR富集制备得测序文库，对测序文库进行定量和质控，经定量的测序文库采用基因测序仪进行高通量测序，得出测序数据，采用生物信息分析软件对测序数据进行分析，得到mtDNA变异相关信息；本发明可以快速检测线粒体环基因突变情况，且可信程度高。CN114350778ACN114350778A权利要求书1/2页1.一种用于检测线粒体环基因突变的引物对，其特征在于，所述引物对为引物对M4或引物对M5；所述引物对M4为：M4‑F：AAGTGAACTGTATCCGACATCTGGTTCC，M4‑R：TAGCTACCCCCAAGTGTTATGGGC；所述引物对M5为：M5‑F：ATAAAGCCTAAATAGCCCACACGTTCC，M5‑R：GACCCTGAAGTAGGAACCAGATGTCG。2.一种用于检测线粒体环基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对。3.根据权利要求2所述用于检测线粒体环基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2体积份的PCR扩增液、4体积份的2.5MdNTP、4体积份的5M甜菜碱、0.2体积份的TaKaRaLATaqHS、7.8体积份的无核酸酶纯化水和1体积份的权利要求1所述引物对。4.一种用于检测线粒体环基因突变的非疾病诊断的检测方法，其特征在于，包括：(1)提取DNA，利用权利要求1所述引物对对mtDNA进行长片段扩增；(2)对所述步骤(1)扩增的产物进行片段化、末端修复、连接接头、纯化和PCR富集制备得测序文库，对所述测序文库进行定量和质控，经定量的测序文库采用基因测序仪进行高通量测序，得出测序数据；(3)采用生物信息分析软件对所述测序数据进行分析，得到mtDNA突变相关信息。5.根据权利要求4所述用于检测线粒体环基因突变的非疾病诊断的检测方法，其特征在于，在所述步骤(1)后、所述步骤(2)之前对所述步骤(1)扩增的产物进行质检，从所述引物对M4与M5扩增的产物中选择一个特异性较好的进行所述步骤(2)。6.根据权利要求5所述用于检测线粒体环基因突变的非疾病诊断的检测方法，其特征在于，所述质检包括：使用0.8％琼脂糖凝胶对所述步骤(1)扩增的产物进行质检，使每个样本使用所述引物对M4和M5扩增的产物至少有一个对比Marker在目标区域可以观测单一的特异性条带，若没有，则重新进行所述步骤(1)。7.根据权利要求4所述用于检测线粒体环基因突变的非疾病诊断的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)对mtDNA进行长片段扩增的条件为：8.根据权利要求4所述用于检测线粒体环基因突变的非疾病诊断的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中对所述测序文库进行定量和质控包括：所述测序文库的浓度大于5ng/μL、体积大于10ul，所述测序文库的片段长度为200‑500bp。9.权利要求1所述用于检测线粒体环基因突变的引物对在制备检测线粒体环基因突变试剂中的应用。2CN114350778A权利要求书2/2页10.权利要求2或3所述用于检测线粒体环基因突变的试剂盒在制备检测线粒体环基因突变试剂中的应用。3CN114350778A说明书1/8页用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测线粒体环基因突变的引物对、试剂盒及检测方法。背景技术[0002]线粒体是能