用于SNP位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114277108A(43)申请公布日2022.04.05(21)申请号202111520984.2(22)申请日2021.12.13(71)申请人上海交通大学附属第一人民医院地址200080上海市虹口区武进路85号申请人迈克生物股份有限公司(72)发明人武春涛文春描龙江唐羚容董汉光赵雨航顾海涛龙腾镶(51)Int.Cl.C12Q1/6858(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书14页序列表4页附图5页(54)发明名称用于SNP位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法(57)摘要本发明涉及一种用于SNP位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法。所述引物探针组合包括：一条反向引物，所述反向引物能够与待测靶标序列特异性配对结合；一条通用探针，所述探针不与任何已知物种的基因序列配对结合，且所述探针上修饰有检测基团；两条正向引物，所述两条正向引物的3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针部分或全部相同。利用所述引物探针组合或包括所述引物探针组合的试剂盒进行SNP位点检测的方法操作简便快捷、闭管检测、重复性好、仪器和试剂成本均低且准确性高。CN114277108ACN114277108A权利要求书1/2页1.一种用于SNP位点检测的引物探针组合，其包括：一条反向引物，所述反向引物能够与待测靶标序列特异性配对结合；一条通用探针，所述探针不与任何已知物种的基因序列配对结合，且所述探针上修饰有检测基团；两条正向引物，所述两条正向引物的3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针部分或全部相同。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针的相似性不同，使得两条正向引物的反向互补序列与所述通用探针的退火温度Tm值相差5℃以上。3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化。4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。5.一种用于SNP位点检测的试剂盒，其包括如权利要求1‑4中任意一项所述的引物探针组合。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增试剂；优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；进一步优选地，所述DNA聚合酶为Taq酶。7.一种利用如权利要求1‑4中任意一项所述的引物探针组合或者权利要求5或6所述的试剂盒检测SNP位点的方法，其包括以下步骤：S1，将待测样本的核酸模板、所述的引物探针组合以及扩增试剂混合，形成反应体系；S2，对所述反应体系进行PCR扩增；S3，判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；其中，所述PCR扩增时的退火温度设置为在所述两条正向引物的反向互补序列与通用探针的不同退火温度Tm值之间的温度。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤：S3‑1，对步骤S2中PCR扩增后的产物进行熔解曲线分析判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；优选地，还包括：S3‑2，采集步骤S2中PCR扩增所产生的信号变化，结合所述信号变化产生的扩增曲线判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内均出现熔解峰时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；优选地，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线不呈S形时，表明所述待测样本为野生2CN114277108A权利要求书2/2页型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线呈S形时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物