用于质粒定量的引物探针组合和试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114134212A(43)申请公布日2022.03.04(21)申请号202111539487.7(22)申请日2021.12.16(71)申请人青岛汉唐生物科技有限公司地址266000山东省青岛市高新技术产业开发区河东路369号(72)发明人杨帆陈欢田永帅刘嘉男王含宋金玲刘万建高文晓(74)专利代理机构青岛中天汇智知识产权代理有限公司37241代理人韩丽萍(51)Int.Cl.C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表2页附图3页(54)发明名称用于质粒定量的引物探针组合和试剂盒(57)摘要本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于质粒定量的引物探针组合和试剂盒，包括一对核苷酸序列如SEQID：1‑2所示的氨苄青霉素抗性基因特异性引物和核苷酸序列如SEQID：3所示的AmpRP探针；还包括一对核苷酸序列如SEQID：4‑5所示的卡那霉素抗性基因特异性引物和核苷酸序列如SEQID：6所示的KanP探针；两个探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。引物探针组合用于试剂盒，可以进行多重PCR反应，达到定量含有AmpR或Kan的质粒的目的，通用性高，可对含有这两个抗性基因序列之一的所有质粒进行定量，是一种通用的方法，且数据可信度高，保证了定量结果的真实性及可溯源性。CN114134212ACN114134212A权利要求书1/1页1.一种用于质粒定量的引物探针组合，其特征在于，包括一对核苷酸序列如SEQID：1‑2所示的氨苄青霉素抗性基因特异性引物和核苷酸序列如SEQID：3所示的AmpRP探针，探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；还包括一对核苷酸序列如SEQID：4‑5所示的卡那霉素抗性基因特异性引物和核苷酸序列如SEQID：6所示的KanP探针，探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团为FAM、VIC中的任一种；所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2中的任一种。3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述AmpRP探针在5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；KanP探针在5’端标记VIC荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团。4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合在制备用于质粒定量的试剂盒中的应用。5.一种用于质粒定量的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组合。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系还包括UDG酶、TaqDNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris‑HCl、dNTP、dUTP混合物。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括一组定量标准品、阳性对照品和阴性对照品，其中，定量标准品和阳性对照品为已定量的质粒，阴性对照品为TEBuffer。8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为50℃、5min；95℃、5min；95℃、15s，60℃、30s，40个循环；60℃时采集荧光信号。2CN114134212A说明书1/6页用于质粒定量的引物探针组合和试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于质粒定量的引物探针组合和试剂盒。背景技术[0002]在分子诊断研发工作中，对模板的准确定量是至关重要的。无论是qPCR平台，还是LAMP、NGS等其他平台，模板定量工作应是反应体系研发前的准备工作。[0003]目前，研发工作中所使用的模板包括质粒、假病毒等，对于质粒的定量，现主流方法包括以下几种方法：紫外分光光度法(ThermoNanodrop)或Qubit荧光仪、qPCR法以及数字PCR法。紫外分光光度法和Qubit法需要昂贵的仪器，且这种方法检测核酸的最低浓度极限仍然较高，并不能满足低拷贝模板定量的需求；数字PCR法可定量低至1拷贝的模板，但是其操作繁琐，且所需仪器试剂耗材昂贵，一般作为初次定量，为标准品赋值；qPCR法作为精准度相对较高、成本相对较低的一种实验方法，受到研发工作者的青睐。但是qPCR法也存在一定的缺陷，qPCR法每次都需要通过设计在模板插入序列上的引物进行定量，操作比较复杂，且需要验证引物的效率后再使用，因此亟需一种通用引物序列检测方法对质粒进行定量。发明内容[0004]本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种用于质粒定量的引物探针组合和试剂盒，本发明对AmpR(氨苄青霉素抗性基因)和Kan(卡那霉素抗性基因)进行序列分析，寻找扩增效率高、特异性好的序列，共设计两套不同荧光基团修饰的探针及引物，可以对含有这两种抗性基因序列之一的所有质粒进行定量