用于检测致病疫霉的引物、试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101921832A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CNCN101921832101921832A(43)申请公布日2010.12.22(21)申请号201010145428.7(22)申请日2010.04.13(71)申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市玄武区卫岗1号(72)发明人王源超郑小波张正光孟军(74)专利代理机构北京瑞盟知识产权代理有限公司11300代理人孙民兴杨惠(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图2页(54)发明名称用于检测致病疫霉的引物、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明提供一种用于检测致病疫霉的引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测致病疫霉准确性高、特异性强、灵敏性高，本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，同时能够对田间土壤中的病原物进行检测，本发明对马铃薯和番茄的晚疫病防治具有重要意义。同时本发明对于减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。CN109283ACN101921832ACCNN110192183201921833A权利要求书1/1页1.一种用于检测致病疫霉的引物，其特征在于：其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述。2.一种检测致病疫霉的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包含4种dNTP，10×PCR反应缓冲液，2mMMg2+，1％BSA和Taq酶。4.一种利用权利要求2或3所述的试剂盒检测致病疫霉的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。6.一种用于检测致病疫霉的引物，其特征在于：包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所述。7.一种检测致病疫霉的试剂盒，其特征在于：包含权利要求6所述的引物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：还包含4种dNT，10×PCR反应缓冲液，2mMMg2+，1％BSA，吐温-20和Taq酶。9.一种利用权利要求6所述的引物检测致病疫霉的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求5所述的引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。2CCNN110192183201921833A说明书1/9页用于检测致病疫霉的引物、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种致病疫霉的检测引物、包含该引物的检测试剂盒以及检测方式，属于生物技术领域。背景技术[0002]由致病疫霉(Pyhtophthorainfestans(Mont.)deBary)引起的晚疫病是世界马铃薯和番茄生产上毁灭性病害之一。在温度适宜病害发生的条件下，该病害可导致作物大幅减产甚至绝收。传统的检测植物病害的方法包括直接观察植物组织的发病症状或者分离得到病原物后再进行形态学鉴定。然而直接观察会遗漏发病初期未表现出症状的情况，而且由疫霉菌引起的病害很容易与Pythiumspp.，Fusariumspp.和Rhizoctoniaspp.引起的病害症状相混淆。因此，对于疫霉菌诊断来说，分离得到病原菌的纯培养是非常有必要的。但是，疫霉菌的分离一直比较困难，特别是对于致病疫霉的分离，更是对分离技术提出了较高要求。同时，疫霉菌的鉴定工作也比较困难，因为可以用于鉴定的形态学特征的数目很少，且容易受到环境因素的影响，使得许多疫霉种的鉴定出现了错误。分子检测的出现为植物病害的快速、准确诊断提供了新的思路和方法。近年来，基于PCR的植物病原菌分子检测技术在植物病害防治中起着越来越重要的作用。转录间隔区(ITS)是通常用来作为植物病原菌分子检测的主要靶标之一。但是越来越多的研究发现，部分疫霉菌的ITS序列差异很小，以ITS为靶标设