一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114606265A(43)申请公布日2022.06.10(21)申请号202210359193.4A61K48/00(2006.01)(22)申请日2022.04.07(71)申请人吉林大学地址130011吉林省长春市前进大街2699号(72)发明人李占军钱育强王迪赵丁牛文超高汛(74)专利代理机构吉林长春新纪元专利代理有限责任公司22100专利代理师陈宏伟(51)Int.Cl.C12N15/864(2006.01)C12N15/55(2006.01)C12N9/22(2006.01)C12N9/78(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表11页附图2页(54)发明名称一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器(57)摘要本发明公开了一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器，提供了一种可单个AAV包装的miniABE与miniABE*，miniABE具较大的编辑窗口A3‑A15，miniABE*具有较窄的编辑窗口主要集中于A5，A6；解决了基于SpCas9的ABE系统无法实现单一AAV包被的技术缺点；二者是互补的关系，可根据编辑位置进行合理的版本选择，当致病基因位于距离PAM较近的时候可选择miniABE，当需要较为精确时可以选miniABE*；两种碱基编辑系统为基因治疗奠定了基础，可以用于制备基因治疗药物。CN114606265ACN114606265A权利要求书1/1页1.一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器，其特征在于：包括TadA‑8e和SpCas9缺失变体的两种迷你碱基编辑器；其中，TadA‑8e与SpCas9缺失REC2结构域第144‑296位氨基酸以及HNH结构第786‑855位氨基酸构建的载体命名为miniABE，核苷酸序列如SEQIDNO.1；TadA‑8e与SpCas9缺失REC2结构域第144‑296位氨基酸，HNH结构第762‑855位氨基酸以及TadA‑8e与SpCas9的连接linker构建的载体命名为miniABE*，核苷酸序列如SEQIDNO.2。2.如权利要求1所述的一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器，其特征在于：包括两种AAV载体可用于AAV包被；其中，AAV‑miniABE载体核苷酸序列如SEQIDNO.3；AAV‑miniABE*载体核苷酸序列如SEQIDNO.4。3.如权利要求1所说的一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器在制备基因治疗药物中的医用用途。4.如权利要求1所说的一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器在破坏小鼠PCSK9基因中的的用途。5.如权利要求1所说的一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器，包括以下步骤：miniABE的构建与HEK293FT细胞验证编辑效率，将ABE8e中SpCas9缺失REC2结构域第144‑296位氨基酸以及HNH结构域第786‑855位氨基酸得到miniABE，在HEK293FT细胞中六个位点验证了miniABE系统的编辑效率，编辑效率在10‑43%，其中SiteV位点在A15仍然保持较高的编辑效率13%；miniABE*的构建与HEK239FT细胞验证编辑效率将ABE8e中SpCas9缺失REC2结构域第144‑296位氨基酸，HNH结构域第762‑855位氨基酸以及TadA‑8e与SpCas9的连接linker得到miniABE*，在HEK293FT细胞中六个位点验证了miniABE系统的编辑效率，编辑效率在5‑42%，且miniABE*编辑窗口明显缩小，A5‑A6效率较高；miniABE与miniABE*编辑窗口对比，miniABE编辑窗口较大，A3‑A15都有编辑，miniABE*窗口较小，集中于A5‑A6；miniABE与miniABE*AAV载体构建与N2a细胞转染验证，在小鼠PCSK9基因的4个位点进行验证，AAV‑miniABE效率为9‑21.5%，AAV‑miniABE*效率为6.5‑19.5%；AAV‑miniABE‑P5与AAV‑miniABE*‑P5AAV包装。2CN114606265A说明书1/6页一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器技术领域[0001]本发明公开了一种能够实现单个AAV病毒包被的迷你碱基编辑器，包括TadA‑8e片段和SpCas9缺失变体片段，开发出编辑窗口大的miniABE以及编辑窗口小的miniABE*，能够实现单个AAV病毒包装，更利于基因治疗，具有良好的应用前景，属于生物技术领域。背景技术[0002]CRISPR/Cas9技术在目标位点引入DNA双链断裂（DSB）对生物医药领域起到革命性作用，通过修改或纠正有害基因来促进遗传病的治疗。在sgRNA引导下，C