一种可实现DNA小片段精准删除的腺嘌呤碱基编辑器及其构建与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115925969A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210810655.X(22)申请日2022.07.11(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人祝钦泷刘耀光曾栋昌郑芷晔(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102专利代理师赵崇杨(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/46(2018.01)权利要求书2页说明书17页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种可实现DNA小片段精准删除的腺嘌呤碱基编辑器及其构建与应用(57)摘要本发明公开了一种可实现DNA小片段精准删除的腺嘌呤碱基编辑器及其构建与应用。所述腺嘌呤单碱基编辑器包含融合蛋白ABE8e‑EndoV，所述融合蛋白从N端到C端，依次包含腺嘌呤脱氨酶、Cas核酸酶的缺刻酶变体及肌苷I碱基删除修复核酸内切酶。本发明所述DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器除了具有高效A‑G的碱基替换外，还具有可以产生从被脱氨的A碱基到Cas核酸酶蛋白切割位点区间的9‑13bp的小片段删除的特点。所述腺嘌呤碱基编辑器特别适用于动植物基因组中顺式作用元件的挖掘和研究，同时在目标基因的单碱基替换与饱和突变筛选等方面具有广泛的应用前景。CN115925969ACN115925969A权利要求书1/2页1.一种可实现DNA小片段精准删除的腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV，其特征在于，从N端到C端，依次包含腺嘌呤脱氨酶、Cas核酸酶的缺刻酶变体蛋白及肌苷I碱基删除修复核酸内切酶；或者，所述腺嘌呤脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶突变体；或者，所述腺嘌呤脱氨酶突变体为TadA8e，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；或者，所述Cas核酸酶为Cas9；或者，所述Cas9的缺刻酶变体蛋白为SpCas9缺刻酶变体SpGn，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；或者，所述的肌苷I碱基删除修复核酸内切酶为EndoV，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，或与SEQIDNO.3所示序列同源性为80％的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的可实现DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV，其特征在于，还包含两个分别融合在ABE8e‑EndoV的N端和C端的核定位信号；或者，所述核定位信号为bpNLS，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1所述的可实现DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV，其特征在于，还包含分别连接腺嘌呤脱氨酶TadA8e与SpCas9变体SpGn，SpCas9变体SpGn与肌苷I碱基删除修复关键酶EndoV的蛋白接头序列；或者，所述蛋白接头序列为柔性连接序列。4.根据权利要求1所述的可实现DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV，其特征在于，从N端到C端，依次包含核定位信号bpNLS、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、柔性连接序列、SpCas9变体SpGn、柔性连接序列、肌苷I碱基删除修复关键酶EndoV及核定位信号bpNLS，其氨基酸全序列如SEQIDNO.5所示。5.一种编码权利要求1～4任一所述的可实现DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV的核苷酸；或者，所述核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。6.含有权利要求5所述核苷酸序列的质粒载体。7.权利要求1～4任一项所述的可实现DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV或权利要求5所述核苷酸或权利要求6所述质粒载体在制备可实现DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器中的应用。8.一种可实现DNA小片段精准删除的腺嘌呤碱基编辑器，其特征在于，是将编码权利要求1～4任一项所述腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV的核苷酸序列构建至转化载体上制备得到；或者，所述转化载体为植物转化载体；或者，所述植物转化载体为双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H。9.权利要求8所述DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器的构建方法，其特征在于，先制备编码DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器融合蛋白ABE8e‑EndoV的完整融合DNA序列，再插入至表达载体中，转化宿主菌，提取阳性质粒，测序，获得稳定的DNA小片段精准删除的腺嘌呤碱基编辑器；或者，为插入到双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H的PstI和BamHI之间，获得腺嘌呤碱基编辑器pYL‑ABE8e‑EndoV。10.权利要求8所述DNA小片段精准删除腺嘌呤碱基编辑器在生