一种快速提取瓜类基因组DNA的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103409409A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103409409103409409A(43)申请公布日2013.11.27(21)申请号201310304147.5(22)申请日2013.07.19(71)申请人合肥丰乐种业股份有限公司地址230031安徽省合肥市蜀山区长江西路727号(72)发明人周贤达王兆贤陈会中吴义兵周桂林林茂朱先飞徐丽媛王丽梅程国旺(74)专利代理机构合肥和瑞知识产权代理事务所(普通合伙)34118代理人王挺(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书5页说明书5页附图1页附图1页(54)发明名称一种快速提取瓜类基因组DNA的方法(57)摘要本发明公开了一种快速提取瓜类基因组DNA的方法，特别是一种利用NaOH和异丙醇快速、简便的大规模提取瓜类植物组织基因组DNA的方法。其利用96孔PCR扩增板在传统碱煮法提取后，使用异丙醇对提取产物进行沉淀提纯，大幅度提高了瓜类基因组DNA的提取质量、提取速度及提取规模，满足了后续进行的瓜类作物育种改良、品种纯度分子标记鉴定等相关项目对瓜类基因组DNA的需要；同时，本方法工艺步骤简单、易于操作且组织需求小，特别适合对瓜类基因组DNA大批量的提取。CN103409409ACN10349ACN103409409A权利要求书1/1页1.一种快速提取瓜类基因组DNA的方法，其特征在于按下述步骤依次操作：（1）瓜类植物组织选取：选取2-2.5mm3瓜类植物的幼嫩部位组织；（2）基因组DNA的提取：将选取的瓜类植物组织放置于96孔PCR板的底部，碱煮法提取基因组DNA；（3）基因组DNA的沉淀：将碱煮后的96孔PCR板置于离心机进行离心后，依次提取其每孔内的上清液并移至另外一个96孔PCR板的各孔内，各孔内再加入50-100μL的异丙醇，置于-20℃冰箱内冰冻保存；（4）基因组DNA的重溶：将步骤（3）沉淀基因组DNA的96孔PCR板置于离心机进行离心后，吸出每孔内的上清液舍弃；沉淀加入75%乙醇40μL，静置2min，吸出乙醇舍弃；沉淀加入95%乙醇40μL，静置2min，吸出乙醇舍弃；将96孔PCR板倒置于桌面30min，加入100μL的TE缓冲液，即得纯化基因组DNA。2.根据权利要求1所述的一种快速提取瓜类基因组DNA的方法，其特征在于：所述离心机离心转速为3500rpm，离心时间为20min。2CN103409409A说明书1/5页一种快速提取瓜类基因组DNA的方法技术领域[0001]本发明涉及瓜类植物组织基因组DNA的提取方法，属DNA提取技术领域。背景技术[0002]植物组织基因组DNA的提取是实验室操作中经常性涉及的基础操作，特别是从事于植物相关的分子生物学研究中经常需要提取相关植物组织基因组DNA进行后续实验。传统植物组织基因组DNA的提取一般使用CTAB法或SDS法，这种操作方法步骤繁琐、操作难度大、速度缓慢，无法满足实验室对大规模植物组织基因组DNA提取的需要。近年来开发的基因组DNA碱煮法来源于细菌质粒DNA小量制备，其为了满足质粒DNA的提取需求，对细菌细胞膜进行破碎，在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH值至中性时，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而缠连的网状结构，通过离心使两者分离。碱煮法相比传统提取方法速度更快、组织需求小、适合大规模操作，从而越来越引起相关科研工作者的重视。[0003]瓜类植物由于其叶片中包含大量多酚类物质，在提取过程中易与空气中的氧发生氧化，从而影响DNA提取的质量，同时多酚类物质会与PCR反应中的Taq酶结合，影响酶促反应效率，从而降低PCR反应成功率。传统瓜类植物基因组DNA的提取一般使用CTAB法，虽然可以避免多酚类物质的影响，却存在提取时间长、提取步骤繁琐、相关药剂毒性强等缺点，而碱煮法提取虽然避免了CTAB法相关问题，却又存在叶片内多酚类物质无法去除的缺点，导致后续进行瓜类作物育种改良、品种纯度分子标记鉴定等等相关实验时，DNA质量无法满足相关需求。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种工艺步骤简单、易于操作且组织需求小、提取质量高的快速提取瓜类基因组DNA的方法，以满足后续进行的瓜类作物育种改良、品种纯度分子标记鉴定等相关项目对瓜类基因组DNA的需要。[0005]其技术方案是：一种快速提取瓜类基因组DNA的方法，其特征在于按下述步骤依次操作：[0006]（1）瓜类植物组织选取：[0007]选取2-2.5mm3瓜类植物的幼