细菌基因组DNA提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109868269A(43)申请公布日2019.06.11(21)申请号201910066416.6(22)申请日2019.01.24(71)申请人安徽华明太合生物工程有限公司地址230000安徽省合肥市巢湖经济开发区龙泉路6号未名医药产业园一期南区A厂房二楼北侧(72)发明人蒋洪新许旭(74)专利代理机构上海光华专利事务所(普通合伙)31219代理人王华英(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称细菌基因组DNA提取方法(57)摘要本发明公开了一种细菌基因组DNA提取方法，DNA的提取方法包括以下步骤：1)取细菌悬浮液离心除去上清液，用无菌的NE缓冲液洗涤沉淀，接着重悬于无菌TE缓冲液，得一混合液；2)在所述混合液中加入甲提取液，混合并放置；3)在所述混合液中加入乙提取液，混合并孵育；4)在所述混合液中加入乙酸铵混合调整；5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液，并混合至相混匀；6)将所述混合液转移至PhaseLockGelHeavy管中混合，并离心，保留顶部水相；7)在所述水相中加入冷的无水乙醇混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA。本发明的提取方法可有效用于细菌基因组DNA提取，提取效率高，操作简单、方便。CN109868269ACN109868269A权利要求书1/1页1.一种细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，至少包括以下步骤：1)取细菌悬浮液20～40ml，于室温以2000～6000g/分速度，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液；2)在所述混合液中加入甲液，进行混合，于冰上，放置45～60分钟；3)在所述混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃下，孵育40～70分钟；4)在所述混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合；5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀；6)将所述混合液转移至锁相凝胶管中，进行混合，以1000-3000g/分钟的速度，离心5～10分钟，保留顶部水相；7)在所述水相中加入冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA；其中，NE缓冲液为0.15mol/lNaCl、50mmol/lEDTA；TE缓冲液为50mmol/lTrispH8.0、50mmol/lEDTA；甲液为0.5～1ml25mmol/lTrispH8.0、10～20ul10mg/ml溶菌酶、30～70ul10mg/ml核糖核酸酶；乙液为0.5％SDS、50mmol/lTrispH7.5、40mmol/lEDTA、2mg/ml蛋白酶K。2.如权利要求1所述的细菌组DNA的提取方法，其特征在于，在所述6)中，保留的所述顶部水相为加入8～15ml苯酚/氯仿溶液并混合，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟；加入8～15ml氯仿/异戊醇溶液并混合，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟后的顶部水相。3.如权利要求1或2所述的细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述苯酚/氯仿溶液为苯酚与氯仿体积比为25/24。4.如权利要求1所述的细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，在7)中，将所述细菌组DNA在4℃下溶解在所述TE缓冲溶液中，保存。5.如权利要求4所述的细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，向溶解有细菌组DNA的所述TE缓冲溶液中，加入NaCl，调整NaCl的浓度为1～2mol/l，接着再次加入所述冷的冷100％的无水乙醇，获得白色絮状沉淀。6.如权利要求1-5任意一项所述的细菌组DNA的提取方法，其特征在于，所述混合为倒置混合。2CN109868269A说明书1/6页细菌基因组DNA提取方法技术领域[0001]本发明涉及一种细菌基因组DNA提取方法。背景技术[0002]第三代基因测序系统Pacbio测序具有读长长、单分子，无GC偏好性、测序的同时可以检测碱基修饰的独特优势，应用广泛。以往基于传统方法对于测序的细菌基因组DNA的提取方法，需要在4℃以下，以高于10000g/分钟的高速离心下分离提取DNA过程中的有机相和含有DNA的无机相，在这样的严苛的实验条件下，不仅使得实验操作的复杂，而且容易导致实验结果不稳定。此外，传统的细菌基因组DNA的提取方法，提取出的DNA纯度不高，易受到提取液等杂质的污染，而试剂盒法提取DNA的成本又高。因此需要一种简便、高效地细菌基因组DNA的提取方法。发明内容[0003]本发明的目的之一在于提供一种新的细菌基因组DNA提取方法，基于该提取方法的提取效率