用于RNaseP基因的荧光PCR检测试剂盒和检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN104232745104232745A(43)申请公布日2014.12.24(21)申请号201310236070.2(22)申请日2013.06.14(71)申请人江苏默乐生物科技有限公司地址225300江苏省泰州市医药城药城大道1号R19楼(72)发明人于沛郭兴中朱华芳崔慧辉(74)专利代理机构泰州地益专利事务所32108代理人王楚云(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)G01N21/64(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书4页说明书4页附图1页附图1页(54)发明名称用于RNaseP基因的荧光PCR检测试剂盒和检测方法(57)摘要本发明涉及分子生物学领域，具体涉及内标基因人核糖核酸酶P（RNaseP）的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的引物和探针包括用于检测RNaseP基因的特异性上游引物、下游引物和Taqman探针。CN104232745ACN1042375ACN104232745A权利要求书1/1页1.基于人核糖核酸酶P（RNaseP）基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括RT-PCRbuffer、混合酶液、RNaseP引物探针混合液、阳性质控品；其中RT-PCRbuffer包括：PCR缓冲液、dNTPs和MgCl2；混合酶液包括HotStartTaq酶和逆转录酶。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，RT-PCRbuffer中含有：10×Buffer液2.5μL，dNTPs（each10mmol/L）2μL，25mM的MgCl2溶液3μL，用水补足到20.85μL。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，混合酶液中含有：HotStartTaq酶0.3μL和逆转录酶0.1μL。4.一种检测人核糖核酸酶P（RNaseP）基因的引物和探针，其中，所述针对RNaseP基因的上游引物序列SEQIDNO.1；下游引物序列SEQIDNO.2；所述RNaseP特异性TaqMan探针的序列SEQIDNO.3。5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，RNaseP引物探针混合液中含有：10μmol/L的SEQIDNO.1~2各0.75μL，10μmol/L的SEQIDNO.3为0.25μL。6.根据权利要求1所述试剂盒的RNaseP基因荧光PCR检测方法，其特征在于：将样品RNA模板、无RNase水、阳性质控品各2µL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCRbuffer20.85μL、混合酶液0.4μL和RNaseP引物探针混合液1.75μL，配成25μL体系，盖好管盖，进行荧光PCR检测。7.基于权利要求1所述试剂盒的鉴定方法，其特征在于：（1）有效性判定：无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；（2）结果判读：样本检测孔Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；样本检测孔Ct值≤38，该样本结果判断为阳性，样本RNA提取成功；样本检测孔Ct值为38~40，需要复检一次，如果Ct值仍为38~40，则判断为阴性。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测方法中进行PCR扩增反应的条件为：45℃逆转录15~30min；92～97℃预变性1~10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火40s；40～45个循环。2CN104232745A说明书1/4页用于RNaseP基因的荧光PCR检测试剂盒和检测方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种内标基因RNaseP的快速检测试剂盒及其检测方法。[0002]背景技术[0003]核糖核酸酶P（RibonucleaseP，简写为RNaseP）是一种核糖核酸酶，是具有酶活性的核糖核蛋白复合体，在各种生物体内普遍存在。RNaseP的主要功能是切除转移核糖核酸(tRNA)前体的5’端序列、产生成熟tRNA5’端的核糖核酸内切酶。[0004]西德尼·奥尔特曼在1970年代在研究前体tRNA中发现它可以剪切RNA的5’'端，也因此获得了1989年度的诺贝尔化学奖。近期的研究发现核糖核酸酶P也具有一些新的功能，例如人类细胞核中的核糖核酸酶P对于正常并有效地转录多种非编码RNA（包括tRNA、5SrRNA、SRPRNA和U6snRNA）的基因是必要的，这些基因是由RNA聚合酶III（人类细胞中三类主要的RNA聚合酶之一）来进行转录。[0005]所有生物体的核糖核酸酶P都由RNA和蛋白质构成，人类核糖核酸酶P由一个具有催化活性的RNA亚单位以及至少10个