肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105483084A(43)申请公布日2016.04.13(21)申请号201610003131.4(22)申请日2016.01.04(71)申请人英普乐孚生物技术（上海）有限公司地址200030上海市浦东新区康新公路3399弄26号206室(72)发明人谢志明武宁郑蓉蓉熊青卉杨春辉(51)Int.Cl.C12N5/0784(2010.01)C12N5/0783(2010.01)A61K35/15(2015.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法(57)摘要本发明涉及一种肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，利用抗体能分别与肿瘤抗原和DC细胞表面FC受体结合的特性，DC细胞就能通过抗体特异性地摄取肿瘤细胞碎片，从而实现对肿瘤细胞特异性抗原的摄取和递呈。与DC细胞直接与肿瘤细胞裂解物共孵育的方法相比，这种方法对肿瘤细胞抗原的摄取具有特异性，效率更高，从而诱导出更强更多的肿瘤杀伤性淋巴细胞。CN105483084ACN105483084A权利要求书1/1页1.肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一，取新鲜手术切除的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，反复冻融，离心，将肿瘤组织制备成肿瘤组织裂解物；步骤二，从肿瘤患者的外周血获取外周血单个核细胞(PBMC)，使用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，取贴壁细胞用于培养DC细胞，加入含GM-CSF、IL-4和自体血浆的无血清培养基培养；步骤三，DC细胞通过抗体摄取抗原，具体步骤为：DC细胞培养的第0-5天，加入抗体与DC细胞结合，去除未结合的抗体后添加GM-CSF、IL-4和肿瘤组织裂解物；步骤四，24小时后加入DC细胞促成熟剂(含10ng/mlLPS，500IU/mlTNFa)和2％自体血浆促进DC细胞的成熟；步骤五，24小时后生理盐水洗涤收集DC细胞。2.如权利要求1所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤三DC细胞通过抗体摄取抗原的步骤也可以为：将抗体与肿瘤组织裂解物结合，并将添加了抗体的肿瘤组织裂解物加入到DC细胞，添加GM-CSF、IL-4。3.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体；抗体种类为IgG，包括人源、鼠源、兔源、羊源。4.如权利要求3所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，所述抗体为CEA单克隆抗体、PSMA单克隆抗体、CA125单克隆抗体、HER-2/neu单克隆抗体。5.如权利要求4所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，所述抗体的浓度为1～1000ng/ml、GM-CSF的浓度为1000IU/ml、IL-4的浓度为1000IU/ml、肿瘤组织裂解物的浓度为1～1000ug/ml。6.如权利要求5所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，所述抗体的浓度为20ng/ml、肿瘤组织裂解物的浓度为100ug/ml。7.如权利要求6所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤三DC细胞通过抗体摄取抗原的时间为DC细胞培养的第3天。8.如权利要求1-7中任意一项所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述肿瘤组织为CEA阳性的新鲜原位切除的胃癌组织、PSMA阳性的新鲜切除的前列腺癌肺转移组织、CA125阳性的新鲜切除的卵巢癌淋巴结转移组织、HER-2/neu阳性的新鲜切除的乳腺癌组织。9.如权利要求1-8中任意一项所述的肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述GM-CSF的浓度为1000IU/ml、IL-4的浓度为1000IU/ml、自体血浆的浓度为2％。10.如权利要求1-9中任意一项所述的分离培养方法分离培养的肿瘤抗原靶向性DC细胞用于体外制备肿瘤特异性T细胞(CTL)或者直接回输患者体内发挥肿瘤治疗或预防作用。2CN105483084A说明书1/6页肿瘤抗原靶向性DC细胞的制备方法技术领域[0001]本发明属于细胞培养技术领域，涉及肿瘤抗原靶向性DC细胞的分离培养方法。背景技术[0002]DC细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。DC细胞通过MHC分子递呈抗原给T细胞识别，一旦识别了MHC分子递呈的抗原，在这一类T细胞就会发生活化扩增。CD8+T细胞活化后会杀伤表达这一种抗原的靶细胞。因此利用DC细胞的这一特点，可以用肿瘤细胞的特异性抗原负载DC细胞，由DC细胞递呈给T细胞，从而活化肿瘤特异性T细胞，后者