同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法及制得的联合免疫细胞.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105647865A(43)申请公布日2016.06.08(21)申请号201610216881.XC12N5/0784(2010.01)(2010.01)(22)申请日2016.04.07C12N5/0786(71)申请人天津普瑞赛尔生物科技有限公司地址300392天津市南开区滨海高新区华苑产业园（环外）海泰发展二路四号4号楼402A(72)发明人韩洪起鲁振宇刘俊江张冰晶秦臻(74)专利代理机构天津才智专利商标代理有限公司12108代理人王晓红(51)Int.Cl.C12N5/0783(2010.01)权利要求书2页说明书8页附图1页(54)发明名称同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法及制得的联合免疫细胞(57)摘要本发明公开了一种同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法及制得的联合免疫细胞，利用Ficoll密度梯度离心法高效分离获得单个核细胞，并利用细胞培养袋和免疫细胞诱导培养系统获得足量的DC、CIK及NK细胞，最终将诱导的细胞联合培养并应用于临床治疗以达到增强肿瘤杀伤效果的目的。本方法采用美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基和自体血清、多种细胞因子及联合培养技术对DC、CIK及NK分别进行诱导培养并在一定时间点将细胞混合培养及应用，避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏源污染几率，同时增强了最终混合细胞的肿瘤杀伤活性；利用细胞培养袋技术，减少细胞污染几率，适合临床治疗应用。CN105647865ACN105647865A权利要求书1/2页1.一种同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，以外周血或者脐带血为原材料，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK及NK，CIK细胞每隔2天扩大培养、NK细胞每隔3天扩大培养，最终保证能够在14-17天同时达到数量要求，在CIK细胞诱导中，在第7天加入CD28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在NK细胞扩增中，在第1天及第7天使用CD16单抗进行2次刺激的方法提高NK的扩增效率。2.根据权利要求1所述的同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采集人体的外周血或者脐带血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤的流程从中制备出自体血清；2)配置细胞诱导培养基备用DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF；CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2；NK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、300-1000IU/ml的IL-2、20-200ng/ml的IL-12、50-200ng/ml的IL-15；3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入40-50ml免疫细胞培养基、并加入步骤1)中制备的2-4ml的自体血清，孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入40-50mlDC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶，以及预包被20-40ug的CD16McAb的T-175细胞培养瓶中；在预包被CD3McAb的培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基和终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导CIK细胞；在预包被CD16McAb的培养瓶中加入100mlNK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导NK细胞；4)培养第3天，在CIK细胞诱导体系中补加5-10ml的自体血清、30000-100000IU的IL-2继续培养；5)培养第4天，在DC细胞诱导体系中加入30-40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100mlNK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；6)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；7)培养第6天，在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入TNF-a，混合均匀后继续培养；8)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液