一种甾体中间体的生物转化制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110747249A(43)申请公布日2020.02.04(21)申请号201911282257.XC12R1/645(2006.01)(22)申请日2019.12.13C12R1/845(2006.01)C12R1/66(2006.01)(66)本国优先权数据201910720054.82019.08.06CN(71)申请人江苏远大仙乐药业有限公司地址224000江苏省盐城市滨海县经济开发区沿海工业园中山七路1号(72)发明人杜艳刘辉杜江涛王鹏辉单东奇白傲雪刘娟玲(74)专利代理机构北京商专润文专利代理事务所(普通合伙)11317代理人朱栋梁(51)Int.Cl.C12P33/08(2006.01)C12P39/00(2006.01)权利要求书1页说明书11页附图1页(54)发明名称一种甾体中间体的生物转化制备方法(57)摘要本发明涉及一种甾体中间体的生物转化制备方法，属于生物制药技术领域。本发明先制备中间体I的甾体混悬液，然后将混悬液投入含有霉菌种子的发酵培养基中，在霉菌的作用下发生C11位羟化反应，并同时水解C21位醋酸酯，得到中间体Ⅱ。本发明采用乳化投料法取代了有机溶媒溶解底物投料的操作，投入底物的浓度可以提高到15g/L以上，生物转化率提高到90％以上。采用本方法在乳化的同时加入氮源营养物质，在提高底物投料浓度的情况下使生物转化更彻底，生产成本显著降低。CN110747249ACN110747249A权利要求书1/1页1.一种甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，先制备中间体I的甾体混悬液，然后投入含有霉菌种子的发酵培养基中，所述中间体I在霉菌的作用下发生C11位羟化反应，并同时水解C21位醋酸酯，得到中间体Ⅱ。2.根据权利要求1所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，所述中间体I的甾体混悬液制备过程为：(1)将第一氮源物质和表面活性剂溶于适量水中，加热灭菌；(2)投入中间体I，搅拌，使之乳化，得到中间体I的甾体混悬液。3.根据权利要求2所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，步骤(1)所述第一氮源物质包含酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏中的一种或几种；所述第一氮源物质在发酵液中的浓度为2～5g/L。4.根据权利要求2所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，步骤(1)所述表面活性剂包含吐温-80、司盘-80、吐温-40、吐温-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种，所述表面活性剂在发酵液中的初始浓度为0.5～1.0g/L。5.根据权利要求1所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，所述中间体I为：所述中间体Ⅱ为：其中，C16位R为β甲基或α甲基。6.根据权利要求1所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，所述霉菌为金龟子绿僵菌、匍枝根霉、赭曲霉中的一种或几种。7.根据权利要求1所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，所述发酵培养基配比为：第二氮源物质为20～45g/L、葡萄糖为20～40g/L、KH2PO4为1～3g/L、MgSO4为0.5～1.5g/L；所述第二氮源物质为酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏、硫酸铵、磷酸氢二铵中的一种或几种。8.根据权利要求1所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，将甾体混悬液投入发酵液中后，培养温度为25～32℃，通气量0.025～0.75vvm。9.根据权利要求1所述的甾体中间体的生物转化制备方法，其特征在于，发酵转化结束后，将最终培养液灭活并冷却至室温，用有机溶剂进行萃取；所述有机溶剂为醋酸乙酯、醋酸丁酯、三氯甲烷、二氯甲烷、二氯乙烷、己烷、庚烷中的一种或几种。2CN110747249A说明书1/11页一种甾体中间体的生物转化制备方法技术领域[0001]本发明属于生物制药技术领域，特别涉及一种甾体中间体的生物转化制备方法。背景技术[0002]甾体激素类物质是皮质激素药物的主要成分，倍他米松以及地塞米松等都是甾体激素类物质，具有抗炎、抗感染、抗休克和抑制免疫等药理作用。甾体的C11位α-羟化是各种皮质激素合成不可缺少的步骤。与化学合成方法相比较，生物转化具有转化效率高、专一性好等突出优点，所以目前甾体的C11位α-羟化通常由微生物通过发酵过程来完成。[0003]微生物催化羟化反应的酶为胞内酶，甾体底物晶体必须先分散并逐渐溶于水中，然后被微生物吸收并在细胞内经酶催化转化，最后产物排出细胞外并形成新的晶体，完成整个转化过程。可见，要提高投料浓度和转化率，必须同时满足两个条件，首先是物料在发酵液和微生物细胞之间的迁移速度要快，其次是微生物细胞内的酶能够保持较长时间的高活性状态。[0004]由于甾体中间体通常亲水性较差，在对甾体