一种甾体中间体的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112048535A(43)申请公布日2020.12.08(21)申请号202010871528.1(22)申请日2020.08.26(71)申请人江苏远大仙乐药业有限公司地址224000江苏省盐城市滨海县经济开发区沿海工业园中山七路1号(72)发明人杜艳单东奇白傲雪杨旭涛(74)专利代理机构北京商专润文专利代理事务所(普通合伙)11317代理人邢若兰(51)Int.Cl.C12P33/10(2006.01)C12N1/14(2006.01)C12R1/645(2006.01)C12R1/845(2006.01)C12R1/66(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图3页(54)发明名称一种甾体中间体的制备方法(57)摘要本发明涉及一种甾体中间体的制备方法，属于生物制药技术领域。本发明先制备中间体A的甾体混悬液，然后投入含有霉菌种子的发酵培养基中，所述中间体A在霉菌的作用下发生C11位α羟化反应，在转化阶段对发酵液的pH值进行控制，并在发酵后期补加种子液，得到中间体C。本发明提供的技术方案，在转化过程中，增加了控制pH值和后期补种两个技术手段，使得底物中间体A基本消耗殆尽，转化更为彻底，副产物占比可控制在0.7％以下，大幅提高反应效率，解决了甾体中间体转化率低、副产物占比高的问题。CN112048535ACN112048535A权利要求书1/2页1.一种甾体中间体的制备方法，其特征在于，在中间体A发生羟化反应时，对反应液的pH值进行控制，并在反应后期补加种子液，得到中间体C。2.根据权利要求1所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，反应液的pH值控制在5.5～6.5；反应后期补加种子液的体积量为反应液体积的10％～20％。3.根据权利要求2所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下具体步骤：(a)种子液制备：制备霉菌斜面菌种并将其接种于第一培养基中，培养后得种子液；(b)发酵预培养：将步骤(a)得到的种子液接入第二培养基重进行预培养；(c)投料及转化：制备中间体A的混悬液并将其投入步骤(b)的培养液中，在反应过程中使用pH调节剂控制反应液的pH值；(d)补种：按照步骤(a)再次制备种子液，在发酵转化后期将新制备的种子液加入反应液中继续转化；(e)粗品制备：收集滤液，用有机溶剂萃取后浓缩得产物中间体C。4.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述第一培养基包含第一氮源物质、葡萄糖和KH2PO4；所述第一氮源物质为酵母浸粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏中的一种或多种。5.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述第二培养基包含第二氮源物质、葡萄糖、KH2PO4和MgSO4；所述第二氮源物质为蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二铵中的一种或多种。6.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述混悬液的制备方法为：在投料罐中加入表面活性剂以及第三氮源物质，加水溶解，并将混合水溶液灭菌，将投料罐内物料灭菌后冷却至29℃以下，加入一定数量的中间体A，搅拌2小时使之充分乳化；所述表面活性剂为吐温-80、司盘-80、吐温-40、吐温-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种或多种；所述第三氮源物质为酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏中的一种或多种。7.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，中间体A的投料浓度为17～20g/L，反应阶段温度为27～29℃，搅拌速率为180～220rpm，通气量0.4～0.75vvm，转化周期为72～74hr；所述pH调节剂为硫酸、盐酸、磷酸、冰醋酸中的一种或多种。8.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(d)中，在转化进行46～54hr后补加种子液。9.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，所述霉菌为金龟子绿僵菌、匍枝根霉、赭曲霉中的一种或多种。10.根据权利要求1所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，所述中间体A为：2CN112048535A权利要求书2/2页所述中间体C为：其中，C16位为β甲基或α甲基。3CN112048535A说明书1/10页一种甾体中间体的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物制药领域，具体涉及一种甾体中间体的制备方法。背景技术[0002]甾体激素类药物是指分子结构中具有甾体结构的、在临床上广为应用的一类药物，主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，在化学药物体系中占有重要的地位。近年来我国的甾体药物行业发展加速，已成为医药工业体系的重要组成部分。与一般化学药品生产相比，甾体药物的生产技术同时涉及化学合成和生物发酵技术两方面，因此具