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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111647953A(43)申请公布日2020.09.11(21)申请号202010654816.1(22)申请日2020.07.09(71)申请人广州赛乐斯密医学科技有限公司地址510535广东省广州市黄埔区瑞和路79号1期201-211房申请人南方医科大学(72)发明人徐湘民滕祥云李琦黄少亚周姗阳治国陆世鑫(51)Int.Cl.C40B50/06(2006.01)C12Q1/6858(2018.01)权利要求书3页说明书27页序列表16页附图3页(54)发明名称用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒及文库构建方法(57)摘要本发明涉及一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒。其包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶,还包括其他的建库试剂。本发明还涉及一种用于检测地中海贫血基因突变的文库构建方法。其包括步骤一、提供一反应体系;步骤二、杂交;步骤三、酶切纯化;步骤四、延伸连接纯化;步骤五、富集。本发明提供的试剂盒及文库构建方法具有全基因组文库构建、操作简单、实验步骤短、成本低、准确性高、富集效率高达80%以上等优点。CN111647953ACN111647953A权利要求书1/3页1.一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶;还包括其他的建库试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,每一对引物探针组分别包含5’延伸引物和3’阻滞探针;其中,所述5’延伸引物不能被5'端方向核酸外切酶降解,所述5’延伸引物包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列相对应的第二部分;所述3’阻滞探针不能被3'端方向核酸外切酶降解,所述3’阻滞探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列特异性杂交的第二部分;所述多对引物探针组的序列信息如SEQIDNO:1-98所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸外切酶的修饰为硫代修饰,即所述3’阻滞探针的5'端磷酸化修饰,3'端硫代修饰;所述核酸聚合酶为高温耐热核酸聚合酶;所述核酸连接酶为高温耐热核酸连接酶。4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述其他的建库试剂包括:(1)DNA变性液:含有变性剂的缓冲液;(2)引物探针混合液:用于多对引物探针组溶解在杂交缓冲液;(3)核酸外切酶缓冲液;(4)延伸连接缓冲液:为核酸聚合酶和核酸连接酶的PCR反应及连接反应提供反应组分及缓冲环境;(5)延伸连接酶混合液:用于核酸聚合酶及核酸连接酶配比混合;(6)PCR缓冲液:为核酸聚合酶提供反应组分及缓冲环境;(7)TaqDNA聚合酶;(8)磁珠悬浮液;(9)磁珠洗脱液A及磁珠洗脱液B。5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述DNA变性液组分为:0.6875×TE,pH8.0,1.25×GCsolution;所述引物探针混合液组分为:0.003μM/延伸引物,0.006μM/阻滞探针,30mMTris-Cl,150mMNaCl,0.3mMEDTA,pH8.0,5ng/μL鱼精;所述核酸外切酶缓冲液组分为:4.5×ExoIBuffer,20mMMgCl2;所述延伸连接缓冲液组分为:0.76×GCsolution,3.05×HemoKlenTaqBuffer,NAD3.05mM,MgCl27.63mM,dNTP0.61mM;所述延伸连接酶混合液组分为:0.4μlHemoKlenTaq+0.1μlTaqDNAligase;所述PCR缓冲液组分为:1.65×GCbuffer1,0.49dNTP,0.82mMMgCl2;所述磁珠纯化洗脱液A组分为:30mMKCl10mMTris-Cl,pH8.0;所述磁珠纯化洗脱液B组分为:10mMTris-Cl,pH8.0。6.一种用于检测地中海贫血基因突变的文库构建方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、利用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒,提供一反应体系;步骤二、杂交;所述5’延伸引物和所述3’阻滞探针在高温变性、退火过程中与待测样本的目标核酸片2CN111647953A权利要求书2/3页段特异性杂交,获得杂交产物,所述5’延伸引物的3'末端与所述3’阻滞探针的5'末端至少间隔1个核苷酸的距离;步骤三、酶切纯化;对步骤二的所述杂交产物,用核酸外切酶进行消化处理,再用磁珠进行纯化,从而获得经纯化的反应混合物,所述反应混合物中含有未被消化的所述杂交产物;步骤四、延伸连接纯化;在核酸聚合酶作用下,所述5’延伸引物沿目标核酸片段进行DNA链延伸,延伸至