一种线虫试剂盒及其使用方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115669613A(43)申请公布日2023.02.03(21)申请号202211111649.1(22)申请日2022.09.13(71)申请人集美大学地址361000福建省厦门市集美区银江路185号(72)发明人张铃玉黄逸滢李健吴达仁(74)专利代理机构厦门创象知识产权代理有限公司35232专利代理师王凤玲尤怀成(51)Int.Cl.A01K67/033(2006.01)G01N21/84(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图3页(54)发明名称一种线虫试剂盒及其使用方法(57)摘要本发明涉及一种线虫试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括：96孔板、试剂A和试剂B；96孔板中的每个孔含有LB‑胆固醇培养基和秀丽隐杆线虫幼虫；秀丽隐杆线虫幼虫为经同步化后饥饿状态的dauer期线虫；试剂A为大肠杆菌OP50；试剂B为5‑氟脲嘧啶。该试剂盒可长时间存储和即开即用，使研究者摆脱线虫购买、培养等繁琐过程，可工业化生产，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。CN115669613ACN115669613A权利要求书1/1页1.一种线虫试剂盒，其特征在于，包括：96孔板、试剂A和试剂B；所述96孔板中的每个孔含有LB‑胆固醇培养基和秀丽隐杆线虫幼虫；所述秀丽隐杆线虫幼虫为经同步化后饥饿状态的dauer期线虫；所述试剂A为大肠杆菌OP50；所述试剂B为5‑氟脲嘧啶。2.如权利要求1所述的线虫试剂盒，其特征在于，经同步化后饥饿状态的dauer期线虫的制备包括以下步骤：使用M9缓冲溶液将正处于产卵期的雌雄同体的秀丽隐杆线虫从NGM培养基平板上多次冲洗下至50mL离心管中，静止数分钟，待线虫下沉至管底，弃去上清；将线虫液定容至30mL于50mL离心管内，按照线虫液和裂解液2：1的比例，向管中加入裂解液15mL，上下颠倒混合，反应5min后，9000rpm离心3min，弃去上清，收集沉淀；沉淀使用M9缓冲液进行上下混匀，以9000rpm离心3min，重复3次，获得含有虫卵的溶液；将含有虫卵的溶液于25℃的生化培养箱内培养12h，再将培养后的沉淀转到新的培养基平板中培养，不需要添加大肠杆菌OP50，20℃培养12h孵化幼虫L1期；虫卵孵化后不再提供食物，3～4天后线虫进入到饥饿状态，即dauer期线虫幼虫。3.如权利要求2所述的线虫试剂盒，其特征在于，将dauer期线虫幼虫吸取至离心管中，使用无菌水进行稀释至线虫悬液的浓度为3500～4000条/mL，再取线虫悬液至96孔板的各孔中，使得每个孔具有70～80条线虫。4.权利要求1‑3中任一项所述的线虫试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测药物溶解于试剂A中，作为食物喂养96孔板中的秀丽隐杆线虫幼虫，空白组使用等量无菌水替换待测药物；(2)秀丽隐杆线虫幼虫从同期化长成L4期计为0d，96孔板在25℃培养箱内恒温培养，每日用体显微镜观察，并记录秀丽隐杆线虫存活、死亡的数目；(3)以10天为一个周期补加4μL浓度为12.5mg/mL的试剂B，不定期补充菌液和无菌水至寿命周期结束；(4)当用体显微镜观察到身体僵直，不动的线虫时，线虫被记为死亡；爬到培养皿边缘或皿盖干死、钻到琼脂里面的秀丽隐杆线虫从实验中排除；(5)采用相关软件对实验数据进行处理、分析，计算出秀丽隐杆线虫的平均寿命，平均寿命显著高于空白组则证明待测药物具有抗衰老活性，平均寿命低于或等于空白组则证明待测药物不具有抗衰老活性。2CN115669613A说明书1/5页一种线虫试剂盒及其使用方法技术领域[0001]本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种线虫试剂盒及其使用方法。背景技术[0002]随着人民生活质量的提高以及科技的发展，人们对寿命有着更大的期许。因此，从动植物中寻找天然活性成分延缓衰老成为当前的研究热点。构建衰老动物模型，使实验动物呈现与人类相似的衰老表型，是研究人类衰老机制和研发抗衰老活性成分的重要手段。[0003]目前广泛应用的衰老动物模型，涵盖无脊椎动物、鱼类、啮齿动物和非人灵长类等。其中，秀丽隐杆线虫作为研究衰老的关键模式生物，有着得天独厚的优势：一、培养时间短、繁殖迅速，平均生命周期为2‑3周，为实验研究节约大量时间；二、作为一种真核生物，与高等的生物体有一些相同或相似的细胞和分子结构以及细胞信号控制通路，且基因测序已全部完成，基因组完整，从中所获得的生物学信息或可推广应用至更加复杂的生物体(包括人类)；三、线虫结构简单，通体透明，观察方便，譬如采用普通的光学显微镜即可完成对其头部摆动、身体弯曲频率等运动行为。因此，随着对秀丽隐杆线虫衰老机制研究的不断深入，越来越多的研究者利用线虫作为模式生物进行抗衰老化合物的筛选和氧化应激性研究。[0004