一种快速检测咖啡短体线虫的RPA引物对、试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115992250A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202210877836.4(22)申请日2022.07.25(71)申请人河南农业大学地址450003河南省郑州市金水区农业路63号(72)发明人李宇赵湘媛李洪连王珂袁虹霞孙炳剑(74)专利代理机构北京卓胜佰达知识产权代理有限公司16026专利代理师刘冬梅(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种快速检测咖啡短体线虫的RPA引物对、试剂盒及其应用(57)摘要本发明属于寄生虫检测试剂制备技术领域，具体涉及一种检测咖啡短体线虫的RPA引物对、试剂盒及其应用。该RPA引物对包括如SEQIDNO：1所示序列的上游引物和如SEQIDNO：2所示序列的下游引物。该RPA引物对可以通过RPA扩增或PCR扩增检测咖啡短体线虫，灵敏度高，特异性强；对腐烂茎线虫、水稻干尖线虫、小叶螺旋线虫、饰环矮化线虫和其它短体线虫的不同种群均无特异性条带；还可检测出单条或混合线虫DNA样本。CN115992250ACN115992250A权利要求书1/1页1.一种快速检测咖啡短体线虫的RPA引物对，其特征在于，包括如SEQIDNO：1所示序列的上游引物和如SEQIDNO：2所示序列的下游引物。2.咖啡短体线虫的检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物对。3.咖啡短体线虫的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物对或权利要求2所述的咖啡短体线虫的检测试剂。4.一种咖啡短体线虫的检测方法，其特征在于，包括：提取待检测咖啡短体线虫DNA作为模板DNA，利用权利要求1中的RPA引物对进行RPA扩增得扩增产物，根据扩增产物对咖啡短体线虫进行检测。5.根据权利要求4所述的咖啡短体线虫的检测方法，其特征在于，RPA扩增条件包括：在37℃‑45℃进行恒温反应。6.一种咖啡短体线虫的检测方法，其特征在于，包括：提取待检测咖啡短体线虫DNA作为模板DNA，利用权利要求1中的RPA引物对进行PCR扩增得扩增产物，根据扩增产物对咖啡短体线虫进行检测。7.权利要求1所述的检测咖啡短体线虫的RPA引物对或权利要求2所述的咖啡短体线虫的检测试剂或权利要求1所述的咖啡短体线虫的检测试剂盒在检测咖啡短体线虫中的应用。2CN115992250A说明书1/6页一种快速检测咖啡短体线虫的RPA引物对、试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于寄生虫检测试剂制备技术领域，具体涉及一种快速检测咖啡短体线虫的RPA引物、试剂盒及其应用。背景技术[0002]短体线虫(Pratylenchusspp.)是一种迁移性植物根内寄生线虫，寄主众多，分布广泛。短体线虫主要通过口针穿刺取食寄主根部表皮组织，引起植物根系的坏死腐烂。短体线虫入侵植物根系所造成的伤口，又为其它植物病原的侵染提供条件，诱发复合侵染，能够大大加重作物的受害程度。短体线虫对作物的危害程度仅次于根结线虫(Meloidogyne)和胞囊线虫(Heterodera)。咖啡短体线虫(P.coffeae)是对农业生产危害最为严重的短体线虫之一，在我国发生广泛，严重危害玉米、小麦、大豆、芝麻、山药、番茄等多种作物。因此，咖啡短体线虫的快速准确鉴定，对于农业生产和检疫工作具有重要意义，而且植物病原线虫种类的准确鉴定对于作物抗病品种的选育和病害的防治也有重要的指导意义。[0003]短体线虫的种类鉴定中，传统方法是利用形态学特征进行鉴定，然而许多种的形态特征上具有较大的种间覆盖和种内变异，且形态学鉴定需要有较多的单一种类线虫样本，鉴定工作耗时且操作繁琐；随着分子生物学技术的发展，分子鉴定因其鉴定结果的准确性、高效性，可作为形态学鉴定的辅助手段被广泛应用。短体属线虫的分子检测中包括ITS‑RFLP、SCAR技术、PCR鉴定、Realtime‑PCR、LAMP检测和DNA条形码等。这些技术克服了形态学鉴定的部分缺点，可以比较准确的鉴定短体线虫的种类。但这些技术在应用上也都具有一定的局限性，ITS‑RFLP操作上相对复杂且耗时久，极大限制其应用；SCAR技术需要多对引物对单一的DNA样本进行扩增，但引物如果和短体线虫的种类无对应，就无法检出，从而无法鉴别线虫的种类；LAMP检测需要六条引物参与，在65℃恒温1h完成检测，但引物设计复杂，且易出现假阳性。[0004]因此，一种精确、高效且对仪器设备要求低的咖啡短体线虫检测方法是有必要的。发明内容[0005]针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种检测咖啡短体线虫的RPA引物对，使用该引物对咖啡短体线虫