一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105717307A(43)申请公布日2016.06.29(21)申请号201610147268.7(22)申请日2016.03.16(71)申请人四川大学华西第二医院地址610000四川省成都市武侯区人民南路3段20号(72)发明人马芳潘倩徐晨(74)专利代理机构成都天嘉专利事务所(普通合伙)51211代理人邹翠(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)权利要求书2页说明书11页附图1页(54)发明名称一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法(57)摘要本发明提供了一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法。所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktail、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液或者BWW培养液；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；所述的试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液2为含0.05mmol/l乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。通过精子中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。CN105717307ACN105717307A权利要求书1/2页1.一种精子质量评估的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktail、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液或者BWW培养液；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；所述的试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液2为含0.05mmol/l乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。2.根据权利要求1所述的一种精子质量评估的试剂盒，其特征在于：所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。3.根据权利要求1所述的一种精子质量评估的试剂盒，其特征在于：所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。4.根据权利要求3所述的一种精子质量评估的试剂盒，其特征在于：所述荧光试剂的浓度为10mM。5.根据权利要求1所述的一种精子质量评估的试剂盒，其特征在于：所述乙酸钠的pH值为5-6。6.根据权利要求1所述的一种精子质量评估的试剂盒的使用方法，其特征在于：具体步骤如下：A、精子的洗涤收集新鲜液化精液标本，检测缓冲液1洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；B、提取精子蛋白向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度（1）用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋白标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释；（2）按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37℃反应30min，然后用酶标仪读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度；D、测定精子唾液酸酶活性（1）用检测缓冲液2将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入检测缓冲液2稀释；（2）用检测缓冲液2稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即2CN105717307A权利要求书2/2页可。7.根据权利要求6所述的一种精子质量评估的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的B步骤，细胞裂解液的加入体积为精子体积的2-3倍。8.根据权利要求6所述的一种精子质量评估的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的C步骤，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml。9.根据权利要求6所述的一种精子质量评估的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的C步骤，酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。10.根据权利要求6所述的一种精子质量评估