条斑星鲽精子冷冻保存方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101884322A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101884322A(43)申请公布日2010.11.17(21)申请号201010230929.5(51)Int.Cl.(22)申请日2010.07.20A01N1/02(2006.01)(71)申请人中国水产科学研究院黄海水产研究所地址266071山东省青岛市市南区南京路106号(72)发明人柳学周徐永江刘新富陈超孙中之王妍妍曲建忠(74)专利代理机构青岛联智专利商标事务所有限公司37101代理人袁和善权利要求书1页说明书3页(54)发明名称条斑星鲽精子冷冻保存方法(57)摘要一种简单实用的条斑星鲽精子冷冻保存的新方法，包括精液采集、基础液选择、抗冻剂选择、精子稀释与平衡、精子冷冻、精子复苏、精子复苏后受精效果检验。本发明是选取性成熟的亲鱼采集优质精液，选择适宜基础液及抗冻液，精液与基础液按照体积比1∶2混合后，冰上或者4℃平衡5min，按照三步降温法降温至-160℃后停留5min，直接投入液氮中保存；解冻时，将冷冻管在液氮蒸汽中停留3min，迅速投入28℃水浴解冻60s后置于室温下完全溶解，获得可用于规模化苗种繁育所需的大批量的高质量精液。本发明简单易行实用，精液保存解冻后活动率高、受精效果好，平均受精率可达到70％以上，孵化率达到50％以上，与新鲜精液的受精效果和孵化效果相同。为苗种繁育企业规模化育苗，提供了容易操作的精液长期或短期保存技术。CN108432ACN101884322A权利要求书1/1页1.一种条斑星鲽精子冷冻保存方法，其特征在于它的方法内容包括：(1)、精液采集，(2)、基础液选择，(3)、抗冻剂选择，(4)、精子的稀释与平衡，(5)、精子冷冻，(6)、精子复苏，(7)、冻精复苏后的受精效果检验；(1)、精液采集：选择性腺发育成熟的雄性亲鱼，利用150mg/L的MS222麻醉后，采用腹部挤压法获取精液，以吸管和干燥的1.5ml离心管收集精液，精液采集后置于冰上保存，活动率85％以上的精液样品用于精子冷冻；(2)、基础液选择：选用Hank`s液作为基础液，配制方法：CaCl2·2H2O0.185g/L，无水MgSO40.09767g/L，KCl0.4g/L，Na2HPO40.06g/L，NaCl8g/L，NaH2PO40.04788g/L，D-葡萄糖1g/L，NaHCO30.35g/L，以1NHCL调节pH至7.6，备用；(3)、抗冻剂选择：以基础液终浓度的百分比15％DMSO+10％蛋黄作为抗冻保护剂；(4)、精子的稀释与平衡：将精液与预冷的4℃稀释液按照体积比1∶2混合，然后按照要求的体积比加入抗冻剂，在冰上或4℃冰箱平衡4-6min；(5)、精子冷冻：将平衡后的精液和稀释液混合液按照每管1.8ml分装入2ml冻存管中，按照三步降温法进行冷冻保存；即液氮罐颈部约-15℃停留2min；液氮面上约4cm处约-160℃停留5min；再直接投入液氮中保存；(6)、精子复苏：解冻时，先将冻存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留约3min，然后将冷冻管取出迅速置于28℃水浴中解冻60s，管中冻精外层开始融化，取出置于室温下至完全融化；在室温条件下，以自然海水激活精子，检查精子活力；(7)、冻精复苏后的受精效果检验：人工采集成熟条斑星鲽卵子，以新鲜精液和解冻后复苏精液分别进行人工授精；将受精卵置于循环流水孵化系统进行孵化，统计受精率和孵化率。2CN101884322A说明书1/3页条斑星鲽精子冷冻保存方法技术领域：[0001]本发明属于低温生物学精子冷冻保存技术，是一种在超低温环境中长期冷冻保存条斑星鲽精子的简单实用方法。背景技术：[0002]低温生物学是研究低温对生物所产生的影响及低温在与生物有关的各个领域中应用的科学，几乎所有在低于正常生物适于生存的温度下进行的与生物有关的实验研究或理论探索都属于低温生物学的范畴。在种质资源保护方面，用低温保存动物的精子和胚胎，不仅可以在生产实践中实现巨大的经济效益，还可以把优良品种的精子和胚胎长期保存起来，以防传染病等自然灾害造成优良品种灭绝。目前，人们正在利用低温冷冻保存的方法，建立各种生物的遗传种质库以用于各种生物的遗传学研究和生物多样性保护。[0003]自1953年Blaxter首次报道冷冻保存大西洋鲱的精子以来，学者们已经对200多种鱼类精子的冷冻保存技术进行了研究(美国，Oxford出版社，Billardetal.，1995)。在鱼类精子冷冻保存中，所使用最频繁的是保护剂为二甲亚砜(Me2SO)，占所有报道的98％，其次是甘油(GLY)(50％)、乙二醇(EG)(29％)、甲醇(MeOH)(16％)、1，2-丙二醇(PG)(5％)及二甲基乙酰胺占3％，但是蛋黄作为保护剂