奶牛精子低温冷冻保存方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105724366A(43)申请公布日2016.07.06(21)申请号201610208997.9(22)申请日2016.04.06(71)申请人云南中科胚胎工程生物技术有限公司地址650000云南省昆明市经济技术开发区希陶路8号(72)发明人苏雷苏宇飞王姝瑭(74)专利代理机构昆明祥和知识产权代理有限公司53114代理人孟蓉英(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称奶牛精子低温冷冻保存方法(57)摘要一种奶牛精子低温冷冻保存方法，涉及精子保存，尤其是一种对奶牛精子冷冻具有保护作用，能提高冷冻效果的奶牛精子低温冷冻保存方法。该奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法是将奶牛精子放入添加有鸽子蛋卵黄的低温冷冻保存液中进行低温保存，利用鸽子蛋卵黄中含有的低密度脂蛋白对奶牛精子的保护作用，减少奶牛精子复苏后的死亡率。本发明的奶牛精子低温冷冻保存方法，采用鸽子蛋卵黄进行制备，鸽子卵黄对奶牛精子具有更好的保护效果，在此冷冻保存液下，奶牛冷冻精子复苏运动度、运动度复苏率和精子质膜完整率均高于其他已见报道添加不同物种卵黄的冷冻保存液；采用此种保存液，能提高奶牛精液的冷冻效果，在实践生产中易于推广。CN105724366ACN105724366A权利要求书1/1页1.一种奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法是将奶牛精子放入添加有鸽子蛋卵黄的低温冷冻保存液中进行低温保存，利用鸽子蛋卵黄中含有的低密度脂蛋白对奶牛精子的保护作用，减少奶牛精子复苏后的死亡率。2.如权利要求1所述的奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于所述的奶牛精子的低温保存步骤如下：（1）取15-20μL精液放入试管中，然后在试管中加入精液体积量5倍的保存液A进行稀释；（2）将步骤（1）中得到的混合液放入4℃冰浴中放置1小时，然后取与保存液A相同体积量的保存液B，预冷至4℃，分成五等份，分五次加入混合液中，每次加入的时间间隔为6分钟，最后在4℃冰浴放置30分钟；（3）取0.2ml步骤（2）得到的精子混合液装入0.25mL冷冻麦管中，封口后置于液氮表面上方5cm处，冷冻10分钟，然后投入液氮中保存即可。3.如权利要求2所述的奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于所述的保存液A和保存液B中包括柠檬酸钠、青霉素、链霉素、鸽子蛋卵黄、甘油以及Milli-Q水，通过以下步骤制得：（1）鸽子蛋卵黄制备：将鸽子蛋表面清洗消毒后，敲破蛋壳并去除蛋清，用Milli-Q水将完整的卵黄冲洗数遍，将蛋清冲洗干净，然后用吸纸吸干卵黄表面的水分，最后用一次性注射器刺破卵黄膜吸取，得到鸽子蛋卵黄；（2）保存液A制备：在每1000mlMilli-Q水中加入20-30g柠檬酸钠、100ml-300ml鸽子蛋卵黄、60-70mg青霉素以及40-60mg链霉素，混合后以转速7000g进行离心1小时，去除卵黄颗粒，然后取上层清液并调解其pH值至7.0-7.2，得到保存液A；（3）保存液B制备：在步骤（2）中得到的保存液A中加入10-20%的甘油，得到保存液B。4.如权利要求3所述的奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于所述的Milli-Q水指标为产水量为1.2L/min，电阻率18.2MΩ.cm/25℃.总有机碳＜10ppb，热源＜0.001Eu/ml。2CN105724366A说明书1/4页奶牛精子低温冷冻保存方法技术领域[0001]本发明涉及精子保存，尤其是一种对奶牛精子冷冻具有保护作用，能提高冷冻效果的奶牛精子低温冷冻保存方法。背景技术[0002]精子的超低温冷冻保存技术，为家畜品种繁殖和改良，珍惜、濒危动物种质保存、人类不育症治疗等奠定了基础。早在200多年前，人们就知道一些哺乳动物的精子在短暂暴露于稍低温度后仍能存活。自从1951年世界上首次用冷冻并复苏的奶牛精子进行人工授精获得牛犊以来，奶牛精子冷冻技术已非常成熟，应用最为广泛。在奶牛精子冷冻过程中，为了减少冷冻对精子造成的损伤，需要添加一些物质，如卵黄、缓冲剂、糖类物质、抗菌物质、防冻剂及其他物质。在工厂化冻精生产中，卵黄是必不可少的保护物质，目前采用最多的是鸡蛋的蛋黄，但是在冷冻保存后的复苏使用过程中，仍有大量精子死亡，据调查、文献检索以及分析，奶牛精子在冷冻过程中，其效果很稳定，但复苏后依然会有大量精子死亡。发明内容[0003]本发明所要解决的就是现有奶牛精子利用鸡蛋蛋黄作为添加剂，虽然冷冻过程稳定，但是复苏后会有大量精子死亡的问题，提供一种对奶牛精子冷冻具有保护作用，能提高冷冻效果的奶牛精子低温冷冻保存液以及保存方法。[0004]本发明的奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法是将奶牛精子放入添加有鸽子